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为什么荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高? 答：荧光分析法定量的依据是荧光强度与浓度成线性关系，测定的是荧光强度。可采用增强入射光强度或增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度。在紫外—可见分光光度法中测定的是吸光度，而吸光度A＝lgI0/I，如果增大入射光强度，相应也增大了透射光强度，比值仍然不变，不能达到提高灵敏度的目的。所以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，一般高2一3个数量级。 第八章　分子发光 2007-11-8 05级化学教育本科班 ## 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 第八章　分子发光 2007-11-8 05级化学教育本科班 ## 5.荧光定量分析原理 (1)荧光定量关系式 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率? ： If ＝ ? Ia 由比耳定律： Ia ＝I0-It ＝ I0 (1-10-? b c ) If ＝ ? I0(1-10-? b c ) ＝ ? I0(1-e-2.3? bc ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：（参看P.349） If ＝ 2.3 ? I0 ? b c ＝ Kc 荧光定量关系式 （2）定量方法 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。 比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。 （3）影响荧光强度的因素 1）溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。 2）温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。 3）溶液pH的影响 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。 4）各种散射光的影响 5）激发光照射的影响 　　由溶剂产生的散射光（瑞利或拉曼散射）有可能产生较严重的干扰。 　　消除方法：通过选择合适的激发波长来消除。 　　有些荧光物质会发生光分解，使荧光强度降低。 　　消除方法：采用低强度激发光、缩短测定时间。 6）荧光猝灭 　　荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度下降或消失的现象称为荧光猝灭。 　碰撞猝灭：　M＊+ Q(熄灭剂) → M + Q + 热（熄灭） 　　或　M＊+ Q(熄灭剂) → M + Q＊ 氧的熄灭作用：溶液中溶解氧分子可加速系间窜跃。 　自熄灭和自吸收　：荧光物质浓度大时产生。 自熄灭——激发态之间碰撞引起能量损失形成。 自吸收——当荧光光谱与吸收光谱重叠时，荧光被溶液中基态分子吸收。 7）内滤光作用 　　溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾等。 6.荧光定性分析 根据荧光物质的激发光谱和发射光谱可以鉴别化合物。 常用　比较法： 　　在相同的分析条件下，将待测物的荧光发射光谱与预期化合物的荧光光谱比较，若特征峰波长及形态一致，则可能为该物质。也可采用预期化合物的激发光谱进行比较亦可。若使用两者结合，则结果可信度大大提高。 参看P.351图12-3 12.3　　荧光和磷光的分析仪器 四部分组成：激发光源、试样池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 光源：高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)。 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器； 检测器：光电倍增管。 同步扫描技术 同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。 合适的??可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但??15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱； ??60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。 磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法： （1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。 （2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。 12.4　荧光和磷光分析法的特点与应用 1. 特点 （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； （2）