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第二章.细胞生物学研究方法 显微镜技术 细胞的分离和培养 细胞组分的分离和纯化技术 细胞化学和细胞内分子示踪技术 细胞功能基因组学研究技术 第一节 显微技术 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ （一）普通光学显微镜 1. 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 （二）荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。 （四）相差显微镜 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 1.环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。 2. 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。 倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上， 用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） （三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 激光共聚焦扫描显微镜 二、电子显微镜 （一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM （二）扫描电子显微镜 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力为6~10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。 原代培养(primary culture) 直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养 原代培养 （primary culture）：即：直接来自动物机体的首次培养。 传代培养（Passage）：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养。 。 细胞融合 单克隆抗体技术 基因克隆(gene cloning) 这项技术可概括为∶分、切、连、转、选 动物细胞核移植克隆技术 转基因敲除小鼠的获得 利用同源重组(基因打靶)使基因失活的方法 基因敲除是一套组合技术，包括基因重组、细胞分离、转基因等 两个关键技术:体外重组与转基因鼠 基因敲进(knockin) 将外源有功能的基因(基因组中原先不存在.或已失活的基因),转如细胞与基因组中的同源序列进行同源重组,插入到基因组中,在细胞内获得表达,称为基因敲进. 1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆抗体技术，获得1984年诺贝尔医学奖 1997年，英国苏格兰罗斯林研究所 细胞融合技术 动物体细胞克隆 * Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green 透射电子显微镜 TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM 人类红细胞 酵母 人类精子 Low speed High speed Differential centrifugation 差速离心的原理 *