膜片钳前期调研综述.docxVIP

膜片钳前期调研综述膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的(或多个)离子通道分子活动的技术。作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。1．膜片钳技术原理膜片钳技术(patch-clamp technique)是在电压钳技术的基础上发展起来的，采用记录流过离子通道的离子电流，来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道分子活动的技术。该技术将一尖端经加热抛光的玻璃微电极管吸附在只有几平方微米的细胞膜上，通过在玻璃电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使与微电极尖开口处相连的细胞膜的小区域(膜片)与其周围的细胞膜在电学上完全分隔。将膜片内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个膜片钳放大器测量此电流强度，就得到单一离子通道电流。原理（见图1）2.膜片钳技术发展历史膜片钳技术是在电压钳（voltageclamp）技术的基础上发展起来的，电压钳技术由Cole和Marment设计，后经Hodgkin和Huxley改进并成功地应用于神经纤维动作电位的研究。1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。1981年Hamill和Neher等人对最早的膜片钳方法和电子线路做了较大的改进和完善，使其电流测量的灵敏度达到1pA，时间和空间分辨率分别达到10μs和1μm，并已逐步发展出几种适合不同需要的记录模式。根据膜片与电极之间的关系，将这些记录模式分为四种:细胞吸附式、膜内面向外模式、膜外面向外模式、全细胞模式四种。3.膜片钳技术优缺点膜片钳技术对细胞膜通道电流的记录具有很高的分辨率，信息含量大；能够改变细胞膜电位，进行单细胞记录，同时可以控制改变细胞的内外溶液成分，灵活性好；应用范围广，可以分析检测所有的离子通道类型；能记录到pA级电流变化和单通道开关状态，因此具有很高的高灵敏性；相对于荧光标记和放射性标记等手段具有更高权威性和精确性。但是受限于膜片钳技术自身的缺点，仍然存在一些不可避免的问题，如每次只能对单个细胞进行操作，通量低，难以对细胞网络以及细胞间的通信进行研究，不能对胞内液进行方便换取。在测量过程中，由于通道表达的缺乏会造成数据点丢失而引起数据不一致，需进行大量的实验。对操作者的要求也非常高，需要熟练的技术人员进行小心翼翼、耗时耗力地在显微镜下手动控制显微操作仪，完成吸附、加液、换药、测量等一系列工作。4.膜片钳技术主要用途膜片钳技术广泛用于研究细胞离子通道，已经成为研究细胞水平生理功能的常用技术。归纳其主要用途包括：1)分辨单通道电流，直接观察通道开启和关闭的全过程。通过测得的单通道特征参数可鉴别通道类型，同时可验证和研究通道的开关动力学模型。2)单通道记录可以解释某些药物的作用机制，以研究特定药物对电压和递质依赖通道的影响。3)膜片钳的空间分辨率高，在中枢神经系统中可分离细胞体与轴突和树突的电流；在周围神经系统中可深入了解受体的分布区域，绘制细胞表面的特定离子通道的分布图。4)“内面向外”和“外面向外”膜片记录允许任意改变膜片内外溶液成分，分别研究单一组分对通道特征的影响，避免了其他成分的干扰。而全膜片记录可用来研究常规电压钳无法研究的小型细胞，在控制细胞内一定离子浓度的同时监测整个细胞的电活动。这种方法已被用于采用重组DNA技术表达的通道研究。5.膜片钳技术的发展及应用从1976年德国生理学家Neher和Sakmann首先建立膜片钳技术以来，该技术获得了快速的发展，已成为现代细胞电生理学研究中的常规方法，并逐步完善和发展出许多新的技术。1）膜片钳技术与荧光技术的结合荧光探针Fura-2、Fluo-3、Fluo-4等常用于检测细胞内的钙离子浓度，能与钙离子结合，产生较强的荧光，通过膜片微电极将其引入细胞，可以利用膜片钳记录细胞内的钙离子浓度，钙离子的释放及内流等情况，研究细胞膜钙离子通道的开放、关闭的动力学特征及生理学效应。2）穿孔膜片钳技术1988年Horn等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术(perforated patch clamp technique)：即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。穿孔膜片钳技术通过应用一些特定的抗生素在膜片上形成选择性的孔道，不仅保持了电极内与胞内液之间电学的连续性，而且使细胞内环境相对稳定，有利于研究胞内信号转导机制和有rundown现象通道电流的记录，相对于传统的全细胞膜片钳技术实验成功率较高。然而穿孔模式对离子选择性的分子基础目前尚不