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下篇 动物细胞工程第11章 动物细胞培养与表达制备药用蛋白 11.1 动物细胞培养 11.2 动物细胞培养的特点 11.3 培养工具与条件 11.4 体外培养细胞生长和增殖过程 11.5 细胞株与保存 11.6 动物细胞小规模培养 11.7 动物细胞大规模培养 11.8 动物细胞培养的生物反应器 11.9 动物细胞大规模培养的影响因素 11.10 动物细胞表达制备药用蛋白 11.1 动物细胞培养（animal cell culture）是模拟动物体内的生理环境使细胞分裂增殖的一种技术。 体外培养 原代培养（初代培养） 传代培养（继代培养） 原代培养（primary culture）——在首次传代前的培养。培养的细胞称为原代细胞。 传代培养（passage culture/ subculturing）——是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。细胞的体外大量增殖是通过传代培养实现的。 1907年，哈里森（Harrison）采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程，开创了动物组织培养的先河。 1923年，法国学者卡勒尔（Carred）设计的卡氏培养瓶成功地用于培养鸡胚的心肌组织。 1951年，厄尔利（Earle）等人开发了动物细胞体外培养的培养基。 20世纪70年代，发展起来的淋巴细胞杂交瘤技术使动物细胞培养应用进入了一个新的领域。 11.2 动物细胞培养的特点 动物细胞属于真核细胞，结构和成分更复杂，功能也更全面。 贴附 非贴附 动物细胞具有以下特点： ⑴动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。 ⑵动物细胞倍增时间长，生长缓慢。 ⑶培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感。 ⑷动物细胞间主要以聚集体形式存在。 ⑸原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。 ⑹动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。 ⑺对于培养环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等。 ⑻细菌、真菌、病毒、支原体均可导致动物细胞培养物的污染。 ⑼绝大多数哺乳动物细胞只有贴附在固体或半固体的表面才能生长。 11.2.1 贴附型细胞 贴附生长是大多数动物细胞在体内的基本存在方式。 细胞之间相互接触 细胞与细胞外基质结合 形成组织，细胞与周围环境保持联系。 当细胞布满表面后即停止生长。从生长表面脱落进入液体的细胞通常不再生长而逐渐退化。 贴壁培养的细胞可用胰蛋白酶、酸、碱等试剂或机械方法使其脱落下来。 还有一些细胞，既可贴壁生长，也可悬浮生长。 按照体外培养细胞的形态不同： （一）成纤维型细胞 细胞外形：与体内成纤维细胞形状相似，细胞大致呈梭形或不规则形。贴壁后呈长梭形，圆形核位于中央，胞质外伸出2~3个长短不同的突起，生长时呈放射状、漩涡状走向。 多数细胞之间排列疏散，有较大的细胞间隙。有时也相互平行排列，成群细胞呈现放射状、漩涡状等形式。 起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为此种形式。 （二）上皮型细胞 （三）游走型细胞 （四）多形型细胞 （二）上皮型细胞 泛指那些形状上类似上皮细胞的细胞 特点是：扁平状，形态较为规则，细胞贴壁后呈三角形即不规则扁平的多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞。 内胚层与外胚层的细胞 （三）游走型细胞 具有类似巨噬细胞样的特征。在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；胞质常伸出伪足和突起；在培养器皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。 该类细胞不很稳定，外形不规则且不断变化。当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。 具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，例如，颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等 （四）多形型细胞 形态上不规则的细胞 胞体：略呈多角形 胞突：细长形，类似丝状伪足 不常见，神经原和神经胶质细胞 影响细胞形态学特征的主要因素包括： 血清成分、培养基成分及添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。 体外培养的细胞并不一定呈现典型的形态形式，而多呈现的是一些过度性形态。 11.2.2 非贴附型细胞 悬浮型细胞 细胞密度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易，因此易于大规模生产，便于过程的控制。 形态学特点：胞体始终为球形 白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等 11.3 培养工具与条件 11.3.1 工具 多数为玻璃或无毒塑料制成的不同规格、类型的培养瓶、培养皿、培养管等。 多孔塑料培养板：6~96孔 关键仪器：CO2