环介导等温扩增技术简介.ppt

环介导等温扩增技术 Principle of Loop-mediated isothermal amplification 环介导等温扩增法为已知基因的检测提供“简便、快速、 准确、廉价”的基因检测方法 什么是环介导等温扩增？ 环介导等温扩增 环介导等温扩增是“Loop-Mediated Isothermal Amplifi -cation”的简称，是一种“简单、快速、准确、廉价”的基因扩 增方法。 环介导等温扩增的特征是针对目标DNA链上的6个区段设 计4个不同的引物然后再利用链置换型DNA合成酶在一定温度 下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合 成酶、基质等共同置于一定温度下（60-65℃），经一个步骤 即可完成。其扩增效率极高，可在15~60min内实现109~1010 倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需很据扩增产物的 有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断。 环介导等温扩增有哪些优点？ 优点 不需要使双链DNA先变性成单链，省时。 扩增反应在等温下可持续进行。 扩增的效率极高。 针对6个区段使用4种引物，拥有高度的特异性。 不需要PCR仪器，仅仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本 低廉。 扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不 一的片段，检测方法简单。 环介导等温扩增引物如何设计？ 引物的设计 首先在靶基因的3’末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在5’末端 设定B1、B2、B3三个区段，针对这6个区段可以设计4个引物。 3’ 5’ 3’ 5’ F3c F2c F1c B1 B2 B3 B1c B2c B3c F3 F2 F1 Target DNA FIP F3 Primer BIP B3 Primer F1c F2 3’ 5’ F3 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ B2 B1c B3 FIP: FIP引物在3’末端含有与F2c互补的F2区段，在5’末端含有与F1c相同序列的区段。 F3 Primer: F3引物含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。 BIP: BIP引物在3’末端含有与B2c互补的B2区段，在5’末端含有与B1c相同序列的区段。 B3 Primer: B3引物含有与目标DNA上的B3序列相同的区段。 环介导等温扩增引物如何设计？ 引物设计要点 关于各引物的设计，需要专门的支持软件：Primer Explorer。设计 中需特别注意碱基组成、GC含量、二次结构等问题。 F2、B2、F3、B3的3’末端应极力避免AT碱基连续或过多。 扩增领域为F2~B2区段间，引物应该在200bp以内。 包含F2/B2在内的环状部分的长度在40~60bp范围内。 各区段的Tm值应该在60~65℃之间。 若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零。 引物应避免二次结构发生。 各引物的3’端不可含有与其他引物互补的序列。 具体引物设计信息请参照网页：http://primerexplorer.jp/e/ （1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） （8） 解离链 解离链 哑铃状模板构造形成的过程 FIP BIP F3 Primer B3 Primer ＋ ＋ 环状结构 环状结构 环状结构 循环扩增阶段和延伸循环阶段 环介导等温扩增反应的体系 环介导等温扩增法所需的试剂 模板DNA DNA扩增 引物 FIP F3 BIP B3 链置换型DNA聚合酶 dNTPs 反应缓冲液 模板DNA RNA扩增 引物 FIP F3 BIP B3 链置换型DNA聚合酶 dNTPs 反应缓冲液 逆转录酶 PS：当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。 环介导等温扩增反应的操作过程（标准法） 环介导等温扩增法的操作步骤 样本 DNA/RNA提取 等温扩增 检测 约0.5h 1、试剂配制 2、DNA/RNA提取 3、环介导等温扩增反应（扩增） 4、检测 约1.5h 环介导等温扩增反应的检测 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA扩增实例 NTC PS：等温扩增的阳性产物是片段大小不一的梯状条带。 应用浊度检测 环介导等温扩增反应的检测 阳性 阴性 扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。 dNTPs DNA Polymerase DNA-(dNMP)n+nP2O7 P2O74- +2Mg2+ MgP2O7(白色沉淀) ﹣ + 荧光目视试剂检测 环介导等温扩增反应的检测 钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合处