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Welcome to Our Class Gene Engineering 基因工程技术Genetic Engineering Zhong, Weihong, PhD Zhong, Li College of Biological Environmental Engineering 2007-09-12 References: 分子生物学与基因工程习题集 中山大学 王金发等 编著 课程考核方式: 期末笔试, 80﹪; 平时(课堂,网站), 20﹪; 何谓基因工程? (1)相关基本概念 (2)基因工程的诞生 (3)基因工程主要内容 相关基本概念 遗传的物质基础是核酸(DNA或RNA): 除了某些病毒或噬菌体是以RNA作为其遗传信息的载体绝大多数生物是以DNA分子为其遗传信息的载体。 中心法则: DNA以自身为模板进行复制,并通过RNA分子将遗传信息传递给蛋白质分子。其中利用DNA分子为模板合成RNA的过程叫转录;以RNA分子为模板合成蛋白质分子的过程叫翻译。复制,转录,翻译是中心法则的三个主要步骤。 基因: 是指DNA片段,是遗传信息的基本功能单位。 基因工程技术的诞生 1972年,美国斯坦福大学P. Berg等将新的遗传信息插入SV40病毒 DNA,标志着基因工程技术的诞生。 1973年,Cohen等构建了第一个有功能的重组DNA分子(DNA克隆)。 1977年,美国Boyer等人第一次使大肠杆菌产生了人脑的一种激素:生长激素释放抑制素。 基因工程主要内容 外源基因通过体外重组后而导入受体细胞内,使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作叫做基因工程,又称重组DNA技术,基因操作,基因克隆。 基因工程实施的四个必要条件:工具酶,基因,载体,受体细胞。 基因工程的两个基本特点:1.分子水平操作;2. 细胞水平表达。 克隆基因的目的:1.扩增DNA;2.获得基因产物;3.研究基因表达调控;4.改良生物的遗传性。 基因工程基本操作 目的基因的取得 载体的选择 目的基因与载体DNA的体外重组 重组载体引入受体细胞 有生产意义目的基因的取得 从适当的供体细胞(各种动植物及微生物均可选用)的DNA中分离; 通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA (complementary DNA,即互补DNA); 由化学方法合成特定功能基因。 载体的选择(载体必备条件) 是一个有自我复制能力的复制子(replicon); 能在受体细胞内大量增殖,即有较高的复制率; 载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口,使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上; 载体上必须有一种遗传标记,以便及时把极少数“工程菌”或“工程细胞”选择出来。 原核受体细胞载体主要有细菌质粒(松弛型)和λ噬菌体两类。动物细胞载体主要有SV40病毒。植物细胞则主要是Ti质粒。 目的基因与载体DNA的体外重组 限制性核酸内切酶处理或人为地把DNA的3’－末端加上polyA或polyT,可使参加重组的两个DNA分子产生“榫头”和“卯眼”似的互补粘性末端。然后把两者放在较低温度混和“退火”。由于每一种限制性核酸内切酶所切断的双链DNA的粘性末端有相同的核苷酸组分,所以当两者相混时,凡粘性末端上碱基互补的片段,就会因氢键的作用而彼此吸引,重新形成双链。这时,在外界连接酶的作用下,供体的目的基因就与载体的DNA片段接合并被“缝补”(形成共价结合),形成一个完整的有复制能力的环状重组载体－嵌合体(chimaera). 重组载体引入受体细胞 受体细胞可以是微生物细胞,也可以是动物或植物细胞。在所有受体细胞中,目前使用最广泛的还是微生物E.coli(大肠杆菌),当然,另外两种微生物即Bacillus subtilis(枯草杆菌)和Sacchaomyces cerevisiae(酿酒酵母)也正被越来越多地用作基因工程中的受体。 重组载体DNA分子引入受体细胞的方法:若以重组质粒作载体时,可以转化的手段;若以病毒DNA作为重组载体时,则要用感染的方法。 基因工程的应用和发展前景 基因工程在工业上的应用; 基因工程在农业上的应用; 遗传工程在医疗上的应用; 基因工程在环境保护中的应用; 基因工程与基本理论研究。 基因工程在工业上的应用 抗生素生产基因工程菌; 人胰岛素基因工程菌(体); 家蚕产丝蛋白基因工程菌(体) ; 人或动物抗体、干扰素、激素或血细胞介素(interleukin)等的基因工程菌(体) ; 基因工程疫苗; 氨基酸高产基因工程菌; 工业和医用酶制剂高产基因工程菌。 基因工程菌经济效益 基因工程在农业上的应用 固氮基因基因工程:以获得能独立固氮的新型作物品种。研究经费仅及发展氮肥工