基因工程工具酶教学PPT.ppt

重组DNA技术中常用的工具酶 * 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 连接酶 核酸酶 ● ● ● ● 基因工程的工具酶 核酸酶（nucleases） 核酸外切酶 2. 核酸内切酶 DNA分子糖-磷酸主键的破坏称为切口（nick） DNA分子中核苷酸缺失称为缺口（gap） 连接修复3‘端羟基和5’端磷酸基团，形成3‘-5’磷酸二酯键 连接酶 DNA ligase T4噬菌体DNA连接酶 T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase） 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌 连接双链DNA上的单链口（Nick），亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端。 连接平头双链DNA速度很慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行，分子之间的连接。 反应条件：  pH为7.5—7.6， 平端连接用20℃-25℃，粘端连接用12℃左右。 Use ● ● Animation of the ligation process. When the sticky ends of two DNA fragments come together and hydrogen bond through the A-T and G-C pairing, the enzyme LIGASE will form covalent bonds between the two fragments. The Specific Cutting and Ligation of DNA GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G AATTC G G CTTAA G CTTAA AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA AATTC G EcoRI DNA Ligase EcoRI sticky end EcoRI sticky end DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA） RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA） 逆转录酶（以RNA为模板合成DNA） ● ● ● 聚合酶（polymerase） 大肠杆菌DNA聚合酶I (大肠杆菌DNA聚合酶I )Klenow片段 T4 DNA聚合酶 T7 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 ● ● ● ● ● 反转录酶 ● DNA聚合酶 一、大肠杆菌DNA聚合酶 I 1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性 dTTP 3 3 A T G C A A T T G C 5 | | | | 5? T A C G ppi T 1、聚合反应具有方向性: 5’ ? 3’ ? 2、DNA 聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的 3- OH 逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。 3’ 3’ 引物 2）核酸外切酶活性 5’ A G C T T C A G G A T A 3’ | | | | | | | | | | | 3’ T C G A A G T C C T A G 5’ 3’? ? 5’?外切酶活性 5’? ? 3’?外切酶活性 能切除突变的 DNA片段 能辨认错配的碱基对，并将其水解 5’ 3’ 2 应用 1)切口移位法标记DNA 在DNase的作用基础上产生链内切口，应用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切核酸酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5’-端向3’-端移动。若用于聚合反应的原料dNTP带有放射性核素α32P，就能使生成的双链带有标记物。 5’ 3’ 5’ 3’ 2) 3’-粘端的末端标记 先利用此酶的3’→5’外切核酸酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；再以其5’→3’聚合酶活性使其补平，在高浓度的dNTP条件下，使3’-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3’-末端带标记的DNA。 裂解变性 显影 3 合成cDNA的第二链 cDNA 5’ 3’ 5’ 3’ 5’?3’聚合酶活性：催化单核苷酸到 DNA 3’-OH端 3’?5’外切酶活性：从游离的3’端降解单核苷酸 5’?3’外切酶活性：从游离的5’端降解双链DNA成为 单核苷酸 ● ● ● 大肠杆菌D