htk液在灭菌孵育期间对大鼠带瓣管道活性的影响.docVIP

精品论文 参考文献 HTK液在灭菌孵育期间对大鼠带瓣管道活性的影响 徐帆 陈道中 曹华 陈良万 　　（福建医科大学附属协和医院心脏外科 福建福州 350004） 　　【摘要】目的：观察HTK液在灭菌孵育期间对大鼠带瓣管道活性的影响并探讨其作用机制。方法：将SD大鼠随机分成4组，取下主动脉带瓣管道，(1)对照组：带瓣管道不经灭菌孵育直接进行各项指标的检测。(2)实验组A：带瓣管道置于含有RPMI1640培养基和抗生素的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。(3)实验组B：带瓣管道置于含有半量RPMI1640培养基，半量HTK液及抗生素的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。(4)实验组C：带瓣管道置于含有HTK液和抗生素的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。对灭菌孵育后的带瓣管道进行细菌学、细胞活性、组织学检测。结果：各组灭菌孵育后的带瓣管道均未检出细菌及真菌，除对照组之外，实验组C带瓣管道的细胞活性保存最好，组织结构保存最完整。结论：在灭菌孵育期间采用HTK液，能提高大鼠带瓣管道的细胞活性及组织结构的保存效果。其主要机制是在灭菌孵育期间，HTK液中的组氨酸缓冲对能有效维持细胞内外环境的稳定，色氨酸及酮戊二酸作为能量底物，对缺血状态下的带瓣管道提供能量。 　　【关键词】HTK液；带瓣管道；保存 　　【中图分类号】R19 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）09-0252-03 　　同种异体带瓣管道(valved homograft conduit，VHC)因具有正常半月瓣的解剖形态，动力学性能良好，不需使用抗凝剂等诸多优点[1]被广泛应用于临床，其保存方法也成为研究热点。VHC在灭菌孵育期间易出现缺血性损伤，影响保存效果，而HTK液具有强大的缓冲能力及高能量底物，可提高组织对抗热缺血损伤的能力；为改善VHC的保存效果提供了可能。因此，我们通过从动物实验明确HTK液对灭菌孵育过程中带瓣管道活性的影响，并探讨其相关机制，旨在为临床工作中带瓣管道的保存提供新的思路及有价值的保存方法。 　　1.材料与方法 　　1.1 抗生素营养液的配制 　　1）抗生素营养液I：在RPMI1640培养基中加入青霉素(50U/ml)，链霉素(50ug/ml)。 　　2）抗生素营养液Ⅱ：半量RPMI1640培养基及半量HTK液的混合液，并加入加入青霉素(50U/ml)，链霉素(50ug/ml)。 　　3）抗生素营养液Ⅲ：在HTK液中加入青霉素(50U/ml)，链霉素(50ug/ml)。 　　1.2 实验动物及分组 　　采用健康成年雄性SD大鼠40只，体重约250～300g，随机分为4组，每组10只，采用无菌手术法取下主动脉带瓣管道。 　　1）对照组：取下带瓣管道不经灭菌孵育直接进行各项指标的检测。 　　2）实验组A：取下带瓣管道置于含有抗生素培养液I的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。 　　3）实验组B：取下带瓣管道置于含有抗生素培养液Ⅱ的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。 　　4）实验组C：取下带瓣管道置于含有抗生素培养液Ⅲ的无菌标本瓶中4℃灭菌孵育24小时。 　　1.3 细菌学检测 　　在超净台下，取出灭菌孵育后的带瓣管道，PBS液清洗2遍，剪下部分主动脉管壁及瓣叶，行细菌及真菌培养。 　　1.4 细胞活性检测（XTT比色法） 　　可溶性四氮唑（XTT）和电子偶联化合物可以进入活细胞中，线粒体内脱氢酶可将XTT和电子偶联化合物还原为橘红色甲簪产物，在450nm波长下产生吸收峰，吸收峰OD值与活细胞数量呈线性相关。 　　在超净台下取出灭菌孵育后的带瓣管道，PBS液清洗2遍，将带瓣管道剪成1times;1mm大小的组织块备用。于暗室中向96孔板中每一孔内加入无酚红的RPMI1640培养基100ul，XTT染色工作液25ul；每份标本各取一份1times;1mm大小组织块，电子天平上精确称重，置于96孔板中，于5%CO2、37℃的培养箱中孵育4小时；随后将96孔板放入酶标仪中，波长450nm激发光下测定吸收峰OD值；带瓣管道细胞活性以每毫克组织块将XTT还原成甲簪在450nm激发光下产生吸收峰的OD值表示。 　　1.5 组织学检查 　　采用HE染色，观察带瓣管道细胞形态和组织结构。结果判定：带瓣管道的形态学结构半定量分析：按照内皮细胞存在和平滑肌细胞形态基本正常(1级)、内皮细胞部分脱落或部分平滑肌细胞疏松、轻度水肿(2级)、内皮细胞脱落并伴有平滑肌细胞空泡样变性、崩解(3级)分为3个级别。 　　1.6 统计学处理 　　所有数据均采用SPSS 16.0软件进行统计分析， XTT比色OD值采用（x-plusmn;s）表示，采用单因素方差分析进行统计，HE染色