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环介导恒温扩增技术在食品检测中的应用 赵彩红 高强 李明生 徐红伟 西北民族大学生命科学与工程学院 西北民族大学甘肃省动物细胞工程技术研究中心 西北民族大学实验中心 X 关注成功！ 加关注后您将方便地在 我的关注中得到本文献的被引频次变化的通知！ 新浪微博 腾讯微博 人人网 开心网 豆瓣网 网易微博 摘????要： 食品安全问题是每个人关注的问题, 为了维护消费者的利益, 提高生活质量, 实现监管部门对食品质量的现场快速检测是十分有必要的。环介导恒温扩增技术以核酸为靶标进行有效扩增, 具有高特异性、高灵敏度、快速且高效等特点, 因此针对食品的快速检测具有一定的可操作意义。本文针对环介导恒温扩增技术的概要以及在食品领域的掺假问题、转基因成分的检测和食源性病原菌检测等方面进行了综述, 以期为食品领域的现场快速检测提供一定的理论基础。 关键词： 环介导恒温扩增技术; 食品安全; 现场检测; 作者简介：赵彩红 (1994-) , 女, 四川遂宁人, 在读本科生, 主要从事食品检测技术研究。 作者简介：徐红伟 (1983-) , 男, 甘肃积石山人, 硕士, 主要从事动物营养与饲料研究。 收稿日期：2017-07-19 基金：科技部援助项目 (KY201501005) Received： 2017-07-19 舌尖上的中国日益火爆, 舌尖上的安全隐患也越来越严重。近年来, 一系列食物中毒、致病性微生物含量超标等食品安全事件频繁爆发, 诸如20 06年的苏丹红鸭蛋事件、2008年三聚氰胺奶粉事件以及频繁爆发的地沟油事件跟2011年的瘦肉精事件等。在分子生物学高速发展的今天, 如何能快速、有效的进行食品检测已成为监管部门以及基层管理者的难题。 环介导恒温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification) 是由日本学者Notomi 2000年在Nucleic Acids Res杂志上公开的一种新型的基因诊断技术。经过十几年的发展, 目前在大量报道中, 环介导恒温扩增技术以高特异性、高灵敏度、操作简单、耗时短、结果易于鉴定等特点而著称, 已被广泛的用于病原体[1-3]、植物[4-5]等研究领域, 成为分子生物学研究领域的新兴技术。该技术在食品检测方面也有了很大进展, 包括掺假问题, 病原菌的检测、转基因食品检测等。 1 环介导恒温扩增技术的概况 环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) , 其特点是针对靶基因3‘端的F1c, F2c, F3c以及5‘端的B1, B2, B3这6个区域, 设计4种特异性引物, 分别是两对内引物 (FIP和BIP) 以及两对外引物 (F3和B3) , 在Bst链置换酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下进行恒温高效扩增。通过聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR) 可知, DNA的扩增需要经过变性、退火以及延伸3个阶段, 而在60~65℃范围内, DNA双链处于动态的复性与延伸阶段, 能进行DNA的扩增。 LAMP反应一共经过三个阶段, 分别是起始阶段, 循环扩增阶段和延伸阶段。所谓起始阶段便是形成哑铃状模板。反应过程为:当内引物FIP与模板DNA结合延伸时, 外引物F3也与该模板结合, 在Bst链置换酶的作用下, 由FIP引物合成的链被置换下来并通过碱基自我配对形成环状, 同时, 内引物BIP以该置换链为模板, 将环状打开, B3又以该链为模板, 在Bst酶的作用下, 合成另一条链解离, 并碱基自我配对形成哑铃状模板。起始阶段完成后, 反应体系以该哑铃状模板为起始模板, 通过两条内引物 (FIP和BIP) 与模板的不断重复结合、置换、解离进行再循环扩增以及延伸, 30~60 min后, 就能产生大量的具有多重茎环结构的产物, 扩增量可达到109~1010个数量级, 高于PCR的扩增数量级[6]。 LAMP技术自发明以来, 就被广泛的报道有特异性强、灵敏度高、扩增效率高以及省时、简便等特点。 LAMP技术是针对靶基因的六个区域设计四对引物, 与PCR技术的两个区域的两对引物相比, 其特异性极高。陈传[7]等人采用普通PCR技术与LAMP技术在对霍乱弧菌进行比较得知, LAMP反应在65℃条件下扩增60 min检出限为10, 而普通PCR需要在昂贵的热循环仪的辅助下其检出限低于LAMP技术100倍, 这表明LAMP技术高效且灵敏。 LAMP技术的扩增不需要热循环仪, 一个水浴锅就能完成反应, 且在DNA合成时, 有大量的白色的焦磷酸镁沉淀生成, 以浑浊度作为反应的指标, 只用肉眼观察白色浑浊沉淀, 就能鉴定扩增与否, 而不需