人TRAIL在Pichia表达系统中的重组表达研究.pdfVIP

5.人TRAIL在Pichia表达系统中的重组表达 王梁华 章亚南 朱玉平 委永华 彭 燕 冯 煌 焦炳华. 第.二军医大学墓础部分子毒理学教研室 上海 200433 摘要 TRAIL是肿瘤坏死因子家族.新成员.本文在得到TRAIL可溶性 分子编码序列的基础上进行了TRAIL的重组表达研究.将可溶性TRAIL基 因片断插入pIC3.5酵毋表达载体，氛化扭转化睁母GS115，甲醉诱导表达 5天.结果发现在酵母细胞 中重组表达的TRAIL在SDS上呈三聚体形 式，杀伤肿瘤细胞的比活性较原核重组表达复性后的TRAIL有明显提高， 说明TRAIL可能已正确折登并形成活性必须的高级结构.用杭人‘TRAIL多 杭可以确认上述真核表达系统表达了TRAIL重组分子. 类铃if TRAIL:Pichia表达系统:杭肿瘤 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (少mornecrosisfactor-related paoptosis-inducingligand,TRAIL)是新近发现的TNF家族成员之一，又称凋亡 素一2配体 (a}optosisreceptor2 ligand,Apo-2L)0,11。由于TNF参与机体的 免疫调节和炎症反应，并发挥细胞毒作用，因而为世人所瞩目[3,4]。研究表明， TRAIL与TNF和Fas/Ap。一].配体一样，为典型的11型跨膜蛋白，C末端细胞外区 域形成同源三聚体的亚结构，而N末端15-40氨基酸为疏水区域并形成跨膜结 构，整个分子由281个氨荃酸组成。目前发现人TRAIL的膜受体有5种:死亡受 体(deathreceptor,DR)4,DR5，及诱骗受体(decoyreceptor1,DcR1)或称无胞内 区域受体(TRAILreceptorwithoutanintracellulardomain,TRID)。正常细胞可 表达上述3种受体，而肿瘤及转化细胞仅能表达DR4和DR5，或者是约高于正常 细胞100倍的DR5和约低 于10倍的DcR1。另两种受体为DcR2/TRAIL- R4/TRUNDD一一另一种细胞内区域不完全的诱骗受体及OPG一一一个与调节 骨密度有关的受体 [[5,b] 我们在得到中国人TRAIL基因和原核表达的基础上[7,2,91，将其基因插入甲 醇营养型酵母表达系统 P〔ichia)进行重组表达，结果得到了有活性的重组人 TRAIL。本研究为进一步研究TRAIL的作用机理和开展动物实验分析TRAIL体 内抗肿瘤作用打下了基础。 一 、材料与方法 1、引物合成 ‘通讯联 系人 ，Te14Fax:02:10- 322 上游引物:5-GG昼鑫鑫一里工旦旦卫三丝旦ACCATGGTTCAAGAAAAG CAAC-3(插入EcoRI,BamHI两个酶切位点，并加上Kozak保守序列和起始 密码子，黑体与编码TRAIL第103位氨基酸开始的序列互补)(P1); 下游引物:5-CA丝 卫巨亘巫孕 GGTCAGTTAGCC-3(插入EcoR I,XhoI两个酶切位点，黑体与上述的重组质粒互补)(P2), 2, PCR扩增 以RT-PCR产物为模板，P1,P2为引物进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳 鉴定.PCR扩增条件:首轮反应94C5min,65C40s,72Clmin;加入Taq酶; 后续30个循环反应为:94C30s,63C30s,72C45s;末轮反应，94C30s,63C30s, 72ClOmin，完成扩增反应。 3、定向克隆 PCR产物纯化后用EcoRI,BamHI双酶切，质粒pIC3.5同样双酶切，胶 回收酶切片断，T4连接酶连接，转化大肠杆菌，扩增，抽提质粒，鉴定，筛 出重组子。 4,TRAIL与pIC3.5重组质杜转化踌母菌 上述得到的含TRAIL基因的pIC3.5质粒大量扩增后按操作说明书转化甲醇 营养型酵母GS115。简要步骤如下: (1)SalI酶切质粒以线性化，胶回收酶切片断以纯化质粒; (2)5000rpm离心5min隔天接种于30C SmIYPD的GS115,100mmo1/L的 LiCl洗细胞一次，离心收集后备用: (3)担体鲜鱼精DNA煮沸lOmin,骤冷至OC,配成2mg/ml浓度; (4)把下述溶液依次加入酵母细胞:250