人参二醇对造血细胞GATA1和GATA2转录调控蛋白的诱导作用研究.pdfVIP

人参二醇对造血细胞GATA一1和GATA一2 转录调控蛋白的诱导作用* 高瑞兰1 陈小红1徐卫红1B．H．Chon92吴超群3 1浙江中医学院附属医院2澳大利亚新南威尔士大学 3上海复旦大学生命科学院 【摘要】 目的：借鉴研究生长因子作用机理的方法，观察了人参二醇(PDS)对转录调 控蛋白GAT一1，GATA一2的诱导作用，探讨PDS对造血细胞增殖与分化的调控作 TA一2抗体作W毯tern印迹杂交法，分析抗原一抗体结合反应。并用32p标记的具 有与GATA族转录因子共同结合位点的双链寡核苷酸探针作电泳带移动阻滞试验 结合移动试验(supershift 体，以确定复合物条带的成分。结果：(1)W包tem印迹杂交法显示PDS诱导的 录调控蛋白与特异性DNA结合的活性均明显增高，而HL一60细胞结合活性低．且 pershift 物主要与GATA一1，GATA一2抗体结合，分子量增大使特异性条带上移或消失，提 示这种复合物的主要成分为GATA一1，GATA一2转录因子。结论：PDS在细胞内的 加，并与DNA结合活性增高而调控与红细胞发育和巨核细胞分化有关基因的表达； 而GATA一2蛋白合成增加，及与DNA结合活性增加可促进细胞增殖。这些结果提 示PDS不但具有刺激造血细胞增殖，而且能够诱导造血细胞发育和分化的类生长因 子双向效应。 。中国和澳大利亚国际合作项目，受澳方政府科研基金资助，教外司美(1996)973号； 国家中医药管理局资助课题(972025)； 浙江省自然科学基金会资助课题(398499) ·-——·129·-—- 一3在血细胞生成中起重要作用，它们的主要功能是介导造血细胞对生长因子的反应，参与细 胞增殖及分化有关基因的调控。作者以前报道了人参皂甙(Gs)通过刺激正常人和再生障碍 性贫血病人的红系、粒系、巨核系和多向祖细胞增殖而促进血细胞生成，以后又报道了GS在 细胞内的信号传递途径，通过诱导GATA一2转录因子而刺激造血细胞增殖的作用。同时用 流色细胞术观察到GS能促进脐血的CD34+细胞向红系、粒系定向分化(待发表)。其他作者 的研究表明GS在体外还能诱导白血病细胞分化，我们也观察到这种促分化现象，但其作用机 理未明。本文从人参皂甙中进一步分离出人参二醇(PDS)，并借鉴研究生长因子机理的方法， 递途径。 1材料和方法 1．1人细胞株培养和PDS刺激处理 靶细胞。常规培养在含10％小牛血清的IMDM培养基中，分为2组：实验组分别加PDS 5 25 t-g／ml，使细胞与药物 t坚g／ml，对照组不加PDS，培养1个月，细胞作饥饿处理后加入PDS 作用2小时后提取核蛋白。 1．2提取核蛋白 方法按Dinam报道的方法加以改良，细胞经冷PBS洗涤后，悬浮在缓冲液A中，含蛋白酶 000 碎器破碎细胞核，离心沉淀12 r／rain，20min，取上清，测定核蛋白浓度。 1．3蛋白免疫印迹分析(Westernblot) 将10耀核蛋白加入SDS凝胶加样缓冲液20m煮沸后，经SDS—PAGE胶电泳分离后。 Cruz)，室温结合反应1h，加辣根过氧化物酶标记的大鼠或山羊 一20)抗体(0．5艇；Hll，Santa rain，X线片 二抗(1：2000稀释，SantaCruz)，经充分洗涤后用ECL发光剂(Amersham)作用1 曝光1—10min，显影后用光密度扫描仪分析结果，用3次提取的核蛋白重复同样实验3遍。 shift assay，EMSA) 1．4电泳带移动阻滞试验(electrophoreticmobility