人骨形成蛋白3成熟肽基因转化油菜的研讨.pdfVIP

人骨形成蛋白一3成熟肤基因转化油菜的研究 硕士生:张大鹏 导 师:郭蔼光教授 (西北农林科技大学生命科学院，陕西，杨凌712100) 摘 要 人骨形成蛋白3(hBMP-3)属于TGF-0超家族的一员，可以诱导间充质细胞分化 为软骨和骨，在胚胎时期骨骼发育和骨再生修复中起着重要的作用，而且对胚胎发育过程 中中胚层的诱导和分化、造血组织的发育以及神经系统的发育和修复等都起着重要作 用，因而hBMP-3有广阔的市场前景。它在人体内含量极微，尽管研究人员已经在原核 细胞和真核细胞表达系统中分别进行了表达，但是由于原核表达系统缺乏翻译后的加工 修饰，真核表达系统存在成本高、产量低等特点，限制了其在临床上的应用。另外，随 着植物基因工程的迅猛发展，一些疫苗、抗体、细胞因子等异源蛋白在植物中的成功表 达，植物表达系统的优点日益受到关注。因此，本试验在已经构建好的植物表达载体 pCAMBIA1300-hBMP-3m的基础上，通过电击法将其转入根癌农杆菌LBA4404中;建 立了油菜下胚轴的高频率再生体系和高频遗传转化系统;然后通过农杆菌的介导，将人 骨形成蛋白一3成熟肤MP-3m)基因导入油菜中，并对转基因植株进行了检测，借以探 讨人骨形成蛋白在植物中的转化和表达情况，为其在更多的植物上应用提供依据。 试验结果如下: 1、表达载体转化根癌农杆菌 将含有目的基因的表达载体质粒pCAMBIA1300-hBMP-3m通过电击法转化导入根 癌农杆菌LBA4404中，卡那霉素平板筛选阳性克隆，经PCR和酶切鉴定证明表达载体 质粒己转入根癌农杆菌LBA4404中。 2、植株再生体系的建立 采用无菌苗油菜下胚轴为外植体，以MS为基本培养基，筛选出MS+6-BA5.Omg/L+ NAAO.2mg/L培养基来诱导不定芽的分化，并于MS十IBA0.3mg/L的生根培养基上生根， 获得完整再生植株。 3、转化体筛选及植株再生 将预培养2天的外植体与农杆菌菌液侵染2-3分钟后，共培养2天，然后转化到含 Hyg25mg/L的选择培养基上进行分化筛选，在转入含Hyg25mg/L的生根培养基上进行 生根培养。转入外源基因的转化体将会在这一系列筛选过程中发芽、生根，获得转基因 抗性植株。 4、转基因植株的PCR和Southernblot分析 PCR扩增人骨形成蛋白一3成熟肤基因，以及Southernblot分析，证明人骨形成蛋白 召成熟肤基因已导入油菜中。 关键词:人骨形成蛋白一3成熟肤基因 油菜 根癌农杆菌介导法 再生体系 遗传转化 ThestudiesontransgenichBMP-3mgene inrape(BrassicanapusL.) Postgrade:MANGDa-peng Tutor:ProfGUOAi-guang (CollageofLifeScience,NorthwestSci-TechUniversityofAgricultureandForestry, ShaanxiChina712100) Abstract Humanbonemorphogeneticprotein3isamemberofTGF-0superfamily.Itcaninduce thedifferentiationofcartilageandbonetissueinmesenchymalcell,andisimportanttobone self-repairmentandbonedevelopmentduringembryomorphogenesis.Inaddition,someother biologicalactivitiesofhBMP-3havealsobeenfound,suchasinducingdevelopmentof embryoan