禽流感血凝试验质量控制.docVIP

禽流感血凝-血凝抑制试验的质量控制 魏 澍1，魏学义2（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164；2.辽宁省动物卫生监督管理局信息中心，辽宁 沈阳 110003） 禽流感血凝-血凝抑制试验是目前我国各地动物防疫监督机构、出入境检验检疫部门和养殖场对禽鸟进行禽流感疫苗抗体水平监测广泛采用的试验方法。该试验方法具有经济、快速可靠、操作简便和对抗体水平进行量化的优点，能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽类血样的禽流感抗体滴度水平，但试验的结果受操作技术的影响很大，试验过程中的质量控制十分关键。 ?1　样品的采集和处理??? ?1.1 样品的采集 气温在23 ℃以上时，采集完的活禽血样在2 h内就可以析出清亮的血清。但在气温为10 ℃左右的时候，采集完的活禽血样的血清很难自然析出，最好立即将采样针筒放入37 ℃培养箱中孵育2～3 h，便可见血清析出。????1.2 待检血清的处理　一般情况下，在5 d内测定的血清样品可放置于4 ℃的冰箱中冷藏， 样品待检时间超过1周的，需低温冰冻保存。????1.3 冻结血清的处理 冻结血清融化后，会出现蛋白质局部浓缩、分布不均的现象。在检测前应充分混匀，混匀时宜轻缓，避免产生气泡以及因剧烈的振荡而引起血清蛋白的变性，可采用上下颠倒5次的混和方式。检测样品还应避免过多的冻融周期，以防样品抗体受损害，建议不超过3～5个周期。对于切实需要多次分批检测的，可将血清样品分装。????1.4 非特异性凝集素的处理 在该试验中鸡血清极少出现非特异性阳性反应，没有必要在试验前对血清进行预处理。除鸡外，有些禽（如水禽、鸽子）的血清可能对鸡红细胞产生非特异性的凝集，这种特性的确定可用待检血清做血凝试验，如果待检血清也出现凝集红细胞的现象，则说明有非特异凝集素存在，需用鸡红细胞对待检血清进行吸附，以除去非特异凝集素。方法：每0.5 ml的血清中加入0.025 ml的鸡红细胞，轻摇后静置至少30 min，800 g离心2～5 min，收集上清液，即为处理后的血清，或者也可用被检禽种的红细胞。????2　器材的选择和使用????为使器材保持最佳工作状态，应建立选择、使用、维护器材的标准操作程序，所用器材主要有单道、多道可调微量加样器、微量反应板、吸头等，微量反应板、吸头尽量使用一次性产品。????2.1 单道、多道可调微量加样器 在使用前或使用一些时间后均应进行校正或鉴定。使用时需注意：①吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快，冲入加样器内腐蚀柱塞而造成漏气；②为获得较高的精确度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差；③取样时只需按到第1档停点，排样时需按到第2档停点，才能彻底排出，以达到准确的取样量。????2.2　96孔V型微量反应板 建议使用96孔90°V型一次性优质塑料反应板进行HA-HI试验，可避免使用有机反应板因清洗不净和过度磨损而影响试验结果。若使用有机反应板，清洗程序是：试验完毕后，立即将反应板用自来水反复冲洗（以孔底不留沉积的红血球为准），再将沾有洗涤剂溶液的棉拭刷洗凹孔及板面，然后再用自来水反复冲净每个凹孔及板面，待反应板干燥后，放到2%～3%浓度的盐酸中浸泡24 h以上，捞出后用自来水冲洗多次，最后以蒸馏水冲洗2～3次，在温箱中烘干备用。对底部磨损严重的反应板要及时淘汰。????2.3　吸头 吸头经超声波清洗、高压灭菌后可反复使用，使用一段时间后要淘汰、及时更新。????3　缓冲液的配制????试验使用的稀释液必须为0.01 mol/L pH值7.0～7.2的等渗磷酸缓冲液（PBS），不能使用生理盐水，因为试验中使用的稀释液的pH 值对试验有影响。稀释液的pH 值在5.18 以下，红细胞易自凝，pH值在7.18以上凝集的红细胞洗脱加快，而pH值为7时红细胞沉淀最充分，图形最清晰。此外，缓冲液对其他酸碱物质具有一定的缓冲能力，有维持反应体系pH 值的作用，而生理盐水不具备缓冲功能。????4　1% 红细胞悬液的配制????来源于不同个体鸡只的红细胞对禽流感病毒的敏感性不同，一般血凝试验的滴度相差1～2个滴度。有的鸡红细胞有自凝现象，所以试验时最好采用3羽以上成年SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血配制好的红细胞，一定要先观察血沉质量，因为有的鸡红血球沉降慢，静置30 min仍不能沉淀下来，所以不合格的红细胞悬液不能使用，否则会影响试验结果。1%红细胞悬液制备中最后1次洗涤2 000 g离心10 min，进行红细胞压积。建议使用与血清来源相同的禽种红细胞，以避免易产生非特异现象。????5　4个血凝单位抗原的配制????先对抗原做血