LMP1促进鼻咽癌干细胞SP18增殖的作用.docVIP

精品论文 参考文献 LMP1促进鼻咽癌干细胞SP18增殖的作用 肖娟1 张志伟2 张先锋1（通讯作者） 　　1.南华大学附属第二医院耳鼻喉科 湖南衡阳 421001；2.南华大学医学院肿瘤研究所 湖南衡阳 421001 　　【摘 要】目的 探讨LMP1促进鼻咽癌干细胞SP18增殖的作用机制。方法 采用平皿克隆与软琼脂集落形成实验观察LMP1促进SP18细胞增殖中的作用；Western-blot检测NF-кB P65蛋白的表达。结果 1、LMP1羧基端TRADD位点突变后促进SP18细胞增殖的能力降低（plt;0.01）；2、SP18-LMP1TRADD细胞中NF-кB P65蛋白表达水平比SP18-LMP1细胞降低。结论 LMP1通过NF-кB途径促进鼻咽癌干细胞SP18的增殖。 　　【关键词】鼻咽癌干细胞；LMP1；细胞增殖 　　鼻咽癌是我国南方地区常见的恶性肿瘤之一，尤其是广东、湖南等地区。EB病毒感染与鼻咽癌发生有关[1]。潜伏性膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是EB病毒编码的重要致瘤蛋白之一[2]，包括三个羧基端功能活化区（carboxy terminal activating region，CTAR）[3，4]。LMP1第二个功能活性区具有肿瘤坏死因子受体相关死亡区（TRADD）结合位点，该位点为LMP1羧基端重要的功能活性位点[4，6]。LMP1在鼻咽癌干细胞中的作用及调控机制仍不十分清楚。 　　材料与方法 　　1.细胞与质粒 鼻咽癌干细胞SP18由中山大学肿瘤防治中心惠赠，细胞用含5％小牛血清的RPMI1640培养基常规培养。pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD（LMP1羧基端TRADD位点突变体），逆病毒质粒由中南大学肿瘤研究所惠赠[4，6]。 　　2. 建立SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞 将收集的逆病毒RV-LMP1和RV-LMP1TRADD感染SP18细胞37 ℃ 2次，经800?g/ml G418筛选2周后，汇合克隆扩大培养，通过免疫荧光检测SP18细胞中LMP1和LMP1TRADD蛋白的表达，建立SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞。 　　3.免疫荧光观察LMP1的表达 制备SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞爬片，固定、洗片与干燥后，用LMP1一抗37℃孵育1 h，洗片，FITC标记的二抗37℃孵育1 h，洗片，置于荧光显微镜下观察SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞中荧光强度并拍照。 　　4. 平皿克隆形成实验 接种SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞于24孔板中（每孔300个），静置培养2周后，甲醇固定，用0.4 %结晶紫染色，计数形成的克隆数，大于50个细胞者为细胞克隆，计算克隆形成率（%）＝（形成克隆数/接种细胞数）times;100%。 　　5. 软琼脂集落形成实验 制备0.6%的底层琼脂，冷却后，制备0.3%顶层琼脂，（每孔2times;103个细胞），设SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞组，每组3个平行孔，静置培养2周后，计数形成的细胞集落数，大于50个细胞者为细胞集落，计算集落形成率（%）=（形成集落数/接种细胞数）times;100%。 　　6. Western-blot 分别细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度，进行10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每泳道30?g蛋白），分离蛋白，经转膜、封闭，一抗（1：1000）37 ℃孵育PVDF膜1 h，洗涤，二抗（1：2000）37 ℃孵育PVDF膜1 h，洗涤、发光、曝光、显影与定影。 　　7. 统计学分析 采用SPSS16.0软件进行分析，数据以 plusmn;ｓ表示，所有数据通过T-test法检验，以Plt;0.05表示差异有统计学意义。 　　结 果 　　1. 免疫荧光观察LMP1的表达 采用免疫荧光检测SP18细胞中LMP1和LMP1TRADD蛋白的表达，结果显示LMP1和LMP1TRADD蛋白表达于SP18细胞浆与膜（图1）。 　　 　　＃SP18-LMP1 vs. SP18-LMP1TRADD，plt;0.05 　　3. Western-blot检测SP18细胞中NF-кB P65蛋白的表达 结果显示，SP18-LMP1细胞中NF-кB P65蛋白的表达较高于SP18-LMP1TRADD细胞（图2），说明LMP1羧基端TRADD位点缺失后SP18细胞中NF-кB蛋白表达降低，提示LMP1能经羧基端TRADD位点诱导NF-кB P65蛋白表达。 　　讨 论 　　鼻咽癌的发病与EB病毒感染密切相关，EB病毒常呈现潜伏感染，其编码多种潜伏性蛋白，其中LM