水稻脂氢过氧化物裂解酶基因OsHPL1的克隆和表达.pdfVIP

水稻脂氢过氧化物裂解酶基因OsHPL]的克隆与表达 中文摘要 HPL(脂氮过氧化物裂解酶)是细胞色素P450家族成员，是植物脂氧化LOX(脂 氧合酶)途径的参与酶之一，催化裂解植物LOX的产物一脂氢过氧化物，生成短链醛 和含氧酸。HPL的催化产物不仅与植物杭病、杭虫有关，也是植物特异气味的主要成 分之一。 目前对HPL的研究主要集中于双子叶植物，对于单子叶植物HPL的基因克 隆及相关的研究，还鲜有报道。本试验建立了水稻的HPL酶活性测定体系，测定了 水稻萌发过程中的HPL酶活性，并进行了水稻HPL基因的克隆及表达研究，结果如 下: 1、水稻HPL的酶活性测定 在参考其它植物HPL酶活性测定方法的基础上，建立了水稻的HPL底物发生体 系和酶活性测定体系，并测定了不同贮藏性水稻品种萌发过程中的种胚 9-HPL. 13-HPL活性和不同休眠性水稻品种种子的9-HPL.13-HPL酶活性。结果发现: 萌发过程中，不同水稻品种9-HPL.13-HPL活性都在浸种后2-3天活性最大，然 后开始下降; 打破休眠前不同品种种子9-HPL酶活性差异不大，而13-HPL酶活性与休眠性之 间存在正相关;打破休眠后品种间13-HPL酶活性差异不大，而9-HPL活性与休眠性 呈相关关系。 2、水稻HPL基因的克隆 利用大麦HPL基因作探针，在水稻基因组数据库中搜索到一个高度同源的contig, 通过对该contig的核苍酸序列分析、ORF寻找和翻译蛋白的功能分析，推测其中的一 个与大麦HPL基因高度同源的ORF是水稻HP￡候选基因。利用PCR的方法，克隆 到了水稻HPL基因 O〔sHPLI,Genbank登录号:AY340020),OsHPL]是第一个被 克隆的水稻HPL基因，编码区全长1464bp，没有内元，编码一个488个氨基酸的蛋 白质。SouthernBlot分析结果表明OsHPL1以多拷贝的方式存在于水稻基因组中。 3、水稻HPL基因的表达 进一步将OsHPLI墓因的完全编码区构建入大肠杆菌体外表达载体pET-30a IPTG诱导表达后，得到约60KD的融合蛋白，并进一步检测了融合蛋白的生物活性. 结果表明:OsHPLI具有较高的13-HPL催化活性。运用RTPCR的方法，发现OsHPLI 在水稻幼穗、未成熟胚和叶片中表达量较高，茎中表达量较低.通过软件预测，推断 OsHPLI基因起始密码子至一800bp区域是。sHPLI基因的启动子区域.对OsHPLI巷 因的启动子进行了克隆及功能元件分析，结果表明OSHPLI基因具有组织特异表达元 件，可能受SA.ABA诱导及光调节，并与冷害、干旱等胁迫有关. 关键词:水稻(OryzasativaL.);HPL酶活性;OsHPLI;巷因克隆;脂氮过氧 化物;RTPCR;启动子 CLONINGANDEXPRESSIONOFOSHPLIGENEENCODINGRICE HYDROPEROXIDELYASE Abstract Fattyacidhydroperoxidelyase(HPL)isanovelCytP-450enzymethatcleavesfatty acidhydroperoxidestoformshort-chainaldehydesandoxo-acids,andfurthertoproduce volatileflavormoleculesandpotentialsignalmolecules.Thealdehydeswhichformedby HPLareinvolvedinplantresistanttodiseaseandinsectherbivores.Theyare.also importantconstituentsofthecharacteristicflavorsoffruits,vegetables,andgreenleaves. Now theresearchonHPL focusondicotyledon,andtheresearchonHPI,of monocotyledonstillhaventbeenreported.Inthispaper,theresearchoncloningofrice HPLandenzymeactivityassaywerecarriedoutandseveralres