Taqman实时荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌组织中PTEN、VEGF、RRM1 mRNA表达水平.docVIP

精品论文 参考文献 Taqman实时荧光定量PCR法检测非小细胞肺癌组织中PTEN、VEGF、RRM1 mRNA表达水平 周晓犊 (杭州艾迪康医学检验中心有限公司 浙江杭州 310023) 【摘要】目的 建立快速检测非小细胞肺癌患者PTEN、VEGF和RRM1 mRNA表达水平的体系，并对表达水平进行评价。方法 以正常人外周血构建PTEN、VEGF、RRM1和管家基因actin的定量标准曲线，利用实时荧光定量PCR法中的“双标准曲线”模型对80例肺癌患者和200例正常人的上述基因表达水平进行检测。结果 标准曲线呈良好的线性关系。PTEN和VEGF基因在非小细胞肺癌组织中表达分别显著高于和低于正常组织，PTEN、VEGF基因表达与患者的性别、组织学类型无关，而与P-TNM分期存在显著相关性。两者的基因表达呈负相关。RRM1基因表达与患者的性别、组织学类型以及P-TNM分期均不存在显著相关性。结论 Taqman实时荧光定量PCR法能够较好的对非小细胞肺癌患者体内PTEN、VEGF和RRM1 mRNA表达水平进行定量检测并给予客观评价，为后期的治疗和用药提供可靠的依据。 【关键词】 荧光定量PCR PTEN VEGF RRM1 表达水平 【中图分类号】R730.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）20-0079-03 如今，肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。根据病理学分类，确诊的肺癌中约80%-85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。由于缺乏有效的早期诊断手段，初诊时约75％的患者已失去了手术时机，目前，预测NSCLC患者化疗反应主要指标还不甚明确。有观点认为，应当引入个体化的分子标志物指标，以实现非小细胞肺癌个体化治疗和预测[1-2]。 PTEN是1997年发现的新抑癌基因，也是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因[3]，位于染色体10q23，其表达产物PTEN蛋白具有诱导细胞凋亡、抑制细胞周期进展以及抑制细胞迁移、铺展和局部黏附的生理功能[4]。研究表明PTEN基因突变缺失及PTEN蛋白的低表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。VEGF是机体最重要的自分泌生长因子，能特异结合血管内皮细胞，使大分子物质和肿瘤细胞穿透血管进入血液循环，与肿瘤的生长转移有关[5]。肺癌侵袭性生长、转移和预后依赖于血管生长[6]。RRM1基因定位于染色体1lq15.5区域[7]，这是多种恶性肿瘤杂合性易失(1oss of heterozygosity，LOH)区域，称为LOH11A，该区域与恶性肿瘤的转移有关系，约75%的NSCLC患者有这样的杂合性缺失。 现有国内的文献报道中，对肿瘤抑癌基因表达水平的定量检测多采用荧光原位杂交（FISH）[8]，尽管该法是现阶段肿瘤诊断的“金标准”，但是由于存在费时费力、结果判读困难等缺点而难以被广泛使用。随着分子生物学的快速发展，实时荧光定量PCR法以其“实时性”、快速高效、高灵敏度和高特异性等优势逐步被人们所接受，该法可快速、精确的反映患者体内分子靶标的表达情况，还可避免发生污染。因而本研究采用实时荧光定量PCR法对非小细胞肺癌患者的PTEN、VEGF、RRM1 mRNA表达水平进行检测，旨在建立荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织中PTEN、VEGF、RRM1 mRNA表达水平的方法和评价体系。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 反转录试剂盒：ReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO）；荧光定量试剂盒：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix（TOYOBO）；RNA抽提试剂盒：RNeasy FFPE KIT（QIAGEN）；TRIzol Reagent:（Gibco）；常规PCR仪：ABI VERITI PCR仪；荧光定量PCR仪：ABI7500 荧光定量PCR仪；核酸浓度检测仪：NanoDrop 2000 micro-volume spectrophotometer（THERMO）。 1.2 研究对象 非小细胞肺癌患者石蜡切片样本均取自杭州艾迪康医学检验中心病理组。样本均为2011年-2012年间外科手术切除的肺部病变组织，共80例样本，样本信息见表1。正常人的肺部组织切片200例，平均年龄58plusmn;4.3岁，作为对照组。另于艾迪康医学检验中心下属体检中心取50例正常人抗凝血样（EDTA抗凝）1ml，以此作为绘制标准曲线的样本。 表1 非小细胞肺癌患者石蜡切片样本信息 Tab 1 The information of N