试验八转氨酶活性鉴定纸层析法.PDF

实验八 转氨酶活性鉴定（纸层析法） 一、实验目的 1、熟悉纸层析法分离和鉴定生物分子的原理和操作方法； 2 、掌握转氨基作用和转氨基反应及其鉴定方法； 3、了解氨基转换作用在中间代谢中的意义。 二、实验原理 转氨酶是生物体氮代谢的重要酶类，动物肝和豆类植物萌发种子中存在着丰 富的转氨酶。转氨酶催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮酸的α-酮基互换，在氨基酸 的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。生物组织中转 氨酶种类甚多，其中以谷氨酸—丙氨酸转氨酶（谷丙转氨酶）和谷氨酸—草酸乙 酸转氨酶（谷草转氨酶）的活力最强。本实验测定的是谷丙转氨酶的活性，催化 的反应如下： 丙氨酸+α-酮戊二酸→丙酮酸+谷氨酸 通过转氨基作用形成的氨基酸可通过纸层析法检测。氨基酸的纸层析属于分 配层析，滤纸为支持介质，滤纸上所吸附的水为固定相，有机溶剂为流动相。把 混合氨基酸样品点于滤纸上，使流动相经样品点，混合氨基酸在两相溶剂间进行 分配，在固定相中分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度慢；在流动相中 分配比例较大的氨基酸，随流动相移动的速度快。由于各种氨基酸的分配系数不 同，在一定时间内，逐渐集中于滤纸上不同的部位，而彼此分离。层析完毕后显 色，使氨基酸显色形成斑点。 氨基酸的比移值（Rf ）表示如下： 点样原点中心到层析点中心距离（r ） R = f 点样原点中心到溶液前沿距离（R ） 由于各种氨基酸都有其特征的R 值，因此可根据R 值来鉴定被分离的氨基酸。 f f 三、仪器、试剂和材料 1、仪器 （1）层析缸； （7 ）层析滤纸； （2 ）培养皿（直径10cm）； （8 ）毛细管； （3 ）台式离心机； （9 ）5ml 离心管2 支； （4 ）吹风机； （10）玻璃棒； （5 ）恒温水浴； （11）研钵； （6 ）烘箱； （12）移液管0.5ml3 支，2ml1 支。 2 、试剂 （1）0.1mol|L 丙氨酸标准溶液； （2 ）0.1mol|L 谷氨酸标准溶液； （3 ）0.1mol|L α-酮戊二酸（用NaOH 中和至中性pH=7.0~7.2 ）； （4 ）含有0.4mol|蔗糖的0.1mol|L pH8.0 的磷酸缓冲液； （5 ）0.1mol|LpH7.5 的磷酸缓冲液； （6 ）正丁醇； （7 ）85% 甲酸（稀释前需测密度）； （8 ）30%乙酸。 （9 ）0.25%茚三酮丙酮溶液。 3 材料 25~28 ℃发芽24h 绿豆芽。 四、操作步骤 1、酶液的制备 称取2-3g25~28℃萌发不超过24h 的绿豆芽（去皮），放入研钵中加2mLpH8.0 磷酸缓冲液研成匀浆，转入 5mL 离心管，用 1mLpH8.0 磷酸缓冲液冲洗研钵， 转入离心管，每隔数分钟摇动1 次，室温下提取5~10min，4000r|min 离心10min, 取上清液备用。 2 、酶促反应 取三个干净试管编号，按下表分别加入试剂和酶液（单位：mL ）。 管号 1 2 3 0.1mol|L α-酮戊二酸 0.5 0.5 0 0.1mol|L 丙氨酸标准溶液 0.5 0 0.5 酶液 0.5