狂犬病疫苗、治疗抗体及其诊断.ppt

动物脑组织用含抗生素及10％灭活牛血清的EMEM培养液研磨成0％（w/v）悬液后2000g离心30分钟，取上清0.1ml加入0.1ml的N2a细胞悬液（5?105细胞/ml）于96孔微量细胞培养板孔中，37?C 5％ CO2孵箱中培养24小时，甩出培养液，板孔用80％冷丙酮室温固定30分钟，甩干，晾干后加入荧光素标记的抗狂犬病毒核蛋白的抗体，37?C孵育45分钟,PBS洗涤即可通过荧光显微镜观察。胞浆中有黄绿色荧光颗粒的为狂犬病毒阳性，无荧光颗粒者为狂犬病毒阴性。 狂犬病毒抗原的检测与诊断 诊断技术 免疫荧光 快速酶 小鼠颅内 细胞培养 胶体金 实验 免疫诊断 接种 分离技术 免疫层析法 所需时间 2-3h 3-4h 5-10d 20-24h 5-10min 特异性 99.99% 99.96% ND 99.99% ND 敏感性 99.99% 98.06% ND 98.21% ND 二 狂犬病毒抗体的检测（Tests for the determination of rabies antibody） 滴定抗狂犬病抗体是为了测定接种对象在暴露后治疗末期或暴露前免疫的抗体水平。 WHO狂犬病专家委员会认为大于或等于0.5国际单位（IU）/ml的抗体水平才具有足够的保护性，如果滴度低于0.5IU /ml，必须给予加强剂量，直到抗体达到要求的水平。 也可在血库中进行抗体滴定以筛选来自免疫供体的血浆样品，用以制备治疗用人狂犬病免疫球蛋白（HRIG）。 特异狂犬病抗体的检测也有利于不明原因病毒性脑炎病人的病原学诊断。 1973年第七届WHO狂犬病专家委员会推荐的标准检测方法有小鼠中和试验（MNT）空斑减少试验亦即随后发展成的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。 RFFIT为现代试验室的首选方法，其敏感度至少与MNT一致。 小鼠中和试验 三倍系列稀释待测血清 预先滴定过的中和用狂犬病毒 （设已知国际单位的标准血清对照） CVS鼠脑悬液（稀释成30- 300LD50）） 等量混合 37℃保温1小时后 37℃中和1小时 复滴定LD50 颅内接种10-12克小白鼠 ? 观察并记录小鼠发病及死亡情况 ?? 根据试验结果计算中和指数及中和抗体含量 特点： 可定量检测狂犬病毒中和抗体效价； 需专门技术培训，操作较繁琐； 实验周期需14天，耗时长，不利于快速诊断； 需较多试验小鼠，成本高； 动物间的个体差会影响试验结果， 我国药典收录的狂犬病中和抗体滴定法即用此法。 2. 快速荧光灶抑制试验 （RFFIT）： 原理： 将预先滴定致细胞80％感染的攻击毒株CVS与3倍系列稀释的待滴定血清37oC孵育1小时，试验中设包括已知中和抗体国际单位含量的参照血清，再将血清/病毒混和液加入BSR细胞悬液。37oC 5％CO2孵育24小时后，细胞单层用80％冷丙酮固定，加荧光标记的抗核衣壳抗体进行染色，检测未被中和的病毒的存在（荧光灶），通过Reed-Muench法计算待滴定血清中狂犬病毒中和抗体单位。 快速荧光灶抑制试验 三倍系列稀释待测血清 预先滴定过的中和用狂犬病毒 （设已知国际单位的标准血清对照） CVS病毒悬液（致80％细胞感染的病毒量） 等量混合 37℃保温1小时后