糖多孢红霉菌突变体M生物合成3脱氧3羰基红霉内酯B的限速因子研究.pdfVIP

摘 要 糖多孢红霉菌 M 突变体 DOEB 生物合成限 速因子的研究 摘 要 红霉素(erythromycin, Er)是糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea) 的次 生代谢产物，为一类广谱大环内酯类抗生素。近几年上市的第三代大环内酯类 红霉素及其衍生物 （又称为酮内酯类抗生素 ketolide antibiotics ） ，因具有较高 的抗菌活性和显著的抑制呼吸道耐药菌株活性而具有广阔的开发前景。为探寻 经基因工程途径直接改造糖多孢红霉菌的染色体结构而合成的新酮内酯类化合 物 DOEB 产量大大下降的原因，本文以糖多孢红霉菌突变体M 为研究对象，分 别从基因的转录水平、翻译水平和内酯类化合物前体水平，系统研究了糖多孢 红霉菌 M 合成 DOEB 的限速因子。研究结果如下： 在mRNA 稳定性研究中，首先提取、纯化糖多孢红霉菌总RNA ，进行mRNA 反转录，以获得的cDNA 为模板，采用 ABI real-time quantitive 7500 仪器进行 PCR 扩增，实时监测扩增产物量的变化，计算 mRNA 的相对表达量（RQ=2 -△△ Ct ），其中 M 菌株 PKS-TE 基因表达量是 A226 菌株 PKS-TE 基因表达量的 0.65 倍，平均下调了 0.35 倍；M 菌株 PKS-ACP 基因表达量是 A226 菌株 PKS-ACP 基因表达量的 0.69 倍，平均下调了 0.31 倍。结果表明经基因工程改造的糖多红 霉菌 mRNA 表达量稍显降低，其稳定性未受到明显影响。因为突变体 DOEB 产 量下降千倍左右，所以 mRNA 转录水平并不是 DOEB 生物合成的限速因子。 在 PKS 蛋白稳定性研究中，以 PKS 复合体上的 TE 酶域为研究对象，采用 生物信息学对 TE 蛋白氨基酸序列分析，化学合成抗原免疫家兔，分离抗血清， Elisa 鉴定抗体效价。此后提取糖多孢红霉菌 A226/M 不同时期总蛋白，Bradford 法测定其浓度，取等量的各时期菌蛋白与抗体进行 ELISA 检测，数据结果表明 突变体 M 比工程菌A226 蛋白表达量稍有降低，基因突变后 PKS 蛋白的稳定性 亦未受到明显影响。同时取等量的各时期总蛋白进行考马斯亮蓝-银染复染法检 I 糖多孢红霉菌突变体 M 生物合成 3-脱氧-3-羰基-红霉内酯 B 的限速因子研究 测PKS 蛋白复合体的表达情况，进一步证明突变体M 和工程菌A226 合成的PKS 蛋白复合体表达量没有明显差异，排除了翻译水平的限速因子可能性。 在 DOEB 及其前体稳定性研究中，提取糖多孢红霉菌 M 和 A226 不同时期 的发酵液，利用LC-MS 技术检测 DOEB 及其前体表达水平。结果表明，造成 M 突变体DOEB 产量下降的原因是由于在 KR6 突变菌株合成DOEB 前体模块的过 程中，相对于 A226 菌株而言，模块 5 产物的起始合成量降低，并且随着发酵时 间的增加，模块 5 产物检测量增大，发生了累积；同时，合成的 DODEB 在向 DOEB 转化的过程中也受到 EryF 和底物亲和反应效率降低的影响，使得 DODEB 转化速率降低，不能完全转化，最终导致生物合成 DOEB 的能力大大降低，并 且 DOEB 向红霉素A 合成的路径被阻断。 关键词：糖多孢红霉菌；DOEB ；mRNA ；PKS ；前体 II ABSTRACT The research of rate-limiting factor on biosynthesis of 3-deoxy-3-oxo-erythronolide B of Saccharopolyspora erythraea M Mutant ABSTRACT Erythromycins (Er) are macrolide antibiotics, produced by