基于微生物药敏的溶血性链球菌实验研究.docVIP

精品论文 参考文献 基于微生物药敏的溶血性链球菌实验研究 江苏省苏州科技城医院 摘要：根据微生物药敏反映的相关理论与实践研究，目标对溶血性链球菌进行微生物鉴定，对其抗药性进行实验评估，深刻掌握溶血性链球菌的生物药敏机理和感染机制。方法本实验采用病料分离、PCR鉴定、镜检、药敏试验、攻毒试验与微生物化学试验等。结果显示左氧氟沙星、氟苯尼考、头孢曲松、阿莫西林与磷霉素等对该菌的抑制效果很明显，为溶血性链球菌的深层研究提供基层研究参考。 关键词：微生物；药物敏感性；溶血性链球菌； 1.材料与方法 1.1 病原菌分离及镜检 本实验于2016年4月采集溶血性链球菌，无菌接种于普通绵羊血平板。获得细菌后染色、镜检于纯化，并进行溶血试验分析。其中，染色用的是革兰氏染色，镜检、纯化步骤分别如下： 选取载玻片一张并拭净；用灭菌的接种环选取生理盐水一滴，放于载玻片中的中央，挑选取血平板上直径0.1毫米至至1.0毫米、半透明、灰白色、圆形、表面光滑、边缘整齐的单独菌群。将接种环上的细菌加到载玻片的水滴内磨匀，涂成直径约1厘米尺寸的菌层。手持玻片，让菌膜朝上，通过火焰烘烤2至3次固定。将玻片置于空气中，使其自然干燥。加草酸结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染1至2min，然后用水冲洗，滴加碘液冲去残水，并保持碘液覆盖1min，用水冲洗加95％酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。如此重复2至3次用水冲洗。然后加番红花红，染色约1min后保持干燥。干燥后用显微镜察看，如果革兰染色阳性、成对或有链状排列的球形细菌为可疑菌群。36℃ 纯培养可疑菌群, 24 小时 后再次进行革兰染色,对镜检为革兰染色阳性、成对、短链球菌,接种于无菌血平皿36℃培养26小时后, 并置于4℃冰箱储存备用。 1.2 培养基分析 称选取9.6g改良马丁液体培养基粉溶于180毫升超纯水，高压高温灭菌后，凉至60℃左右分装至试管中，每管2至4毫升，3℃储存。称选取16.05g改良马丁液体培养基粉溶于280毫升超纯水，缓慢加入5.5g琼脂粉，高压高温灭菌后，凉至60℃左右倒平皿，直径9厘米的平皿每皿15至20毫升，4℃储存。称选取16.05g改良马丁液体培养基粉溶于280毫升超纯水，缓慢加入5.5g琼脂粉，高压高温灭菌后，凉至60℃左右，缓慢加入5%血清和0.2%的裂解血，混合溶解倒平皿中4℃储存。 2.病原菌微生物化学试验 2.1 糖发酵实验 将实验菌株分别接入麦芽糖、葡萄糖、乳糖、果糖、菊糖、beta;至半乳糖苷、阿拉伯糖、肌醇、鼠李糖、甘露醇、卫矛醇、木糖和山梨醇等微生物化学试剂管中封存36℃培养26小时，察看分析实验结果。 2.2药敏试验 按标准纸片琼脂扩散法操作，将药敏纸片贴在划满病原菌种的血平皿上，放置26小时36℃温箱，并保持纸片间适度距离。本次实验共用9种药品：阿米卡星、新霉素、庆大霉素、阿莫西林、头孢曲松、磷霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考和磺胺甲恶唑等。 2.3 病原菌PCR鉴定 本实验所做的PCR鉴定内容，主要目的在于检验菌株是否含有GDH基因。溶血性链球菌的谷氨酸脱氢酶属于GDH蛋白家族。通过核酸序列分析表明，GDH基因包括一个开放性框架，具有编码448个氨基酸残基，在细胞表面酶活性是NAD(P)H依赖型，作用底物为L一谷氨酸，其编码基因在SS2中存在。SS2的GDH有保守的抗原性，能与感染有毒溶血性链球菌的溶血性链球菌的血清反应，可作为检测溶血性链球菌的重要标志性抗原。若获得GDH基因，则证明该菌株为溶血性链球菌，而且较大实验结果可能会为溶血性链球菌。 2.3 PCR模板的制备 将菌株接入液体培养基，36℃摇床培养16小时后，按照DNA提选取试剂盒使用说明书进行DNA提选取：选取0.5至2毫升培养菌液，0.9万最高转速，离心30秒弃上清，提取菌体，尽可能会吸净上清。缓慢加入200微升缓冲液RB重悬洗涤细胞，0.9万最高转速，离心30秒,弃上清后将细胞吹打重悬于200微升缓冲液RB中。缓慢加入50至90微升溶菌酶上下混合溶解，36℃温浴1h。0.9万最高转速且离心2min，弃上清后将细胞吹打重悬于200微升缓冲液RB中。缓慢加入200微升结合液CB，立即急速摇动上下充分混合溶解，再缓慢加入20微升蛋白酶K（20mg/毫升）溶液，充分混合溶解，60℃置于9min。冷却后，缓慢加入90微升异丙醇，急速摇动上下充分混合溶解，此时可能会出现絮状沉淀。 将上一步所得溶液和絮状沉淀都缓慢加入一个吸附柱AC中， 0.9万最高转速离心30秒，清空提取管中的废液。缓慢加入500微升抑制物去除液IR，1.2万最高转速 离心30秒，弃废液。缓慢加入600微升漂洗液WB，