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混合模式液相色谱固定相的发展及应用摘要：混合型液相色谱是一种能够发生多种互相作用模式的色谱分析方法，在生命研究科学中发挥着重要的作用。作为色谱技术的核心，混合型液相色谱固定相的制备与发展直接影响着色谱分离的选择性和分离效率。目前学术报道的混合型液相色谱固定相种类繁多。本文综述了近几年来不同种类的混合型液相色谱固定相，包括离子/反向混合模式色谱(IEC/RPLC)、亲水作用/反向混合模式色谱(HILIC/RPLC)、亲水作用/离子交换混合模式色谱（HILIC/IEC）等不同类型的应用。关键词：混合型色谱固定相1混合模式液相色谱应用进展在生命科学研究中，很多科学家都经常使用二维液相色谱（2D-LC）或多维液相色谱（mD-LC）来分离复杂的生物样品。因此，科学家通常都需要使用两根甚至多根色谱柱来实现分离，这也使得科学家下定决心去开发具有高分离度和高选择性的快速的液相色谱分析方法。最近，为了应对这一挑战，混合模式色谱得到了关注[1]。近期，混合模式液相色谱得到了发展。混合模式色谱(Mixed-modechromato- graphy)是固定相与溶质分子之间能够发生多种相互作用模式的一种色谱分析方法[2]。混合模式色谱的出现使色谱理论的研究变得更为复杂，但随着可调选择分离性的发展，混合模式色谱也成为一种不可避免的趋势[3]。一些带有不同性质官能团的复杂样品可以通过混合模式液相色谱固定相得到有效的分离[4]。20世纪50年代，高效液相色谱还没有发展起来，混合固定相被用来分离特定的物质，有研究表明当使用等度洗脱时，流速与混合比例之间存在着近乎线性的关系[5]。1986年，Regnier的团队[6]首次合成了用于蛋白质分离的硅胶基质阴离子交换固定相，这使得固定相在阴离子交换色谱及疏水作用色谱中得以应用。这种技术在三年后被Horvath再次确认[7]。1988年，Burton和Harding报道了一种新型的混合模式色谱——疏水电荷诱导色谱，这种色谱对盐浓度没有依赖性但是对pH值的依赖性比较大[8]。在同一年，Strancar等人提出了联合分析液相色谱，这种色谱是把含有不同功能的两个或多个对流相互作用媒质连续的装入同一根色谱柱中[9]。1999年，Yates以及他的同事[10]把具有强阳离子交换作用的固定相与反相液相色谱固定相同时装入一根柱管中并与质谱进行串联连接来进行多肽类物质蛋白质组学分析。2009年，Geng的研究小组使用同时具有弱阳离子交换性能和疏水作用的色谱柱对完整蛋白质进行了快速的在线分离[11]。这种色谱柱与商品化的单一弱阳离子交换色谱柱及疏水作用色谱柱相比，示出了更好的分离性能。同时，课题组的一个作者还把单一色谱柱的二维液相色谱（2D-LC-1C）命名为混合模式色谱，这个名称也显示出了此类色谱与相应的单一模式固定性等同或更为优越的分离性能。混合模式色谱由于其多种优点，混合模式色谱日益得到了人们的关注。近年来，以不同关键点切入介绍混合模式色谱的综述性文献发表了多篇，其中包括1998年的混合模式色谱在核酸方面的研究，2009年配体在混合模式蛋白色谱中的选择性及其它特性研究；2013年Thomas L. Chester在分析化学发表了一篇介绍高效液相色谱今年发展的综述，就在最后一部分介绍了混合模式色谱及其固定相的发展。2015年，Liu等[12]在分析化学发表了具有亲水/反相的混合模式色谱的文章。与传统的单一模式色谱相比，混合模式色谱具备许多优点：较高的选择性[13]。显著的高负载容量[14]。与单一模式色谱柱相比，相应的混合模式色谱柱显示出了更好的分离性，因此可以代替两个或多个单一模式色谱柱[1]。不同模式的色谱可以通过调节流动相的pH值或浓度来进行转换，避免了单一模式色谱换柱子的麻烦。虽然现在已经有许多种混合模式色谱固定相被制备出来，但是如何组合才能才能达到最佳分离至今还没有准确方法。目前，混合模式色谱固定相的制备还处于研究阶段。2 混合模式色谱固定相的制备混合模式色谱固定相的制备方法可以分为物理方法和化学方法。2.1物理方法物理方法中，固定相是由两种或多种填料组成。其物理合成方法有以下几种。一种是把两个商品柱连接在一起，称为“串联柱”。一种是把两个不同的固定相填料充填与同一根色谱柱的两端，称为“两相柱”。还有一种是把两种或多种不同类型的填料混合充填入一根色谱柱中，称为“混合柱”。2.2 化学方法化学方法中，固定性是由单一固定性填料组成，这种填料一般含有两种或多种功能团，这些官能团通过化学合成方法键合到一起。混合模式化学合成方法不同于传统色谱的地方一般是通过硅烷化反应将几种不同类型的官能团通过聚合反应键合在活化硅胶裸露的羟基上。不同模式的色谱之间可以通过调节流动相的pH值或浓度来进行转换。3 各种组合的混合模式液相色谱固定相自从产生