人类白细胞抗原B27三种检测方法的对比.docVIP

精品论文 参考文献 人类白细胞抗原B27三种检测方法的对比 王玉红 王妍妍 李强 (新乡医学院第一附属医院血液病研究室 河南新乡 453100) 【摘要】目的 比较疑似强直性脊椎炎（Ankylosing Spondylitis,AS）患者HLA-B27检测方法的特点，探讨不同检测方法之间差异及各自优缺点，为临床检验提供参考。方法 采用最常见微量淋巴细胞毒试验（MLCT），ELISA法，流式细胞仪法（FCM），对120例疑似（AS）患者的HLA-B27抗原进行检测。将三者结果进行比较分析。结果 微量淋巴细胞毒法检测强直性脊椎炎患者阳性率HLA-B27为39.2%；ELISA法检测HLA-B27阳性率45%；流式细胞仪法检测HLA-B27阳性率40.8%。结论 三种检测方法之间具有较高的一致性 【关键词】强直性脊椎炎 人类白细胞抗原 B27 人类白细胞抗原（HLA-B27）是组织细胞上受遗传控制的个体特异性抗原，其位于人的第6号染色体HLA.基因B座位点上27等位基因[1]。主要症状为腰疼、脊椎僵硬、运动受限。X线显示有两侧骶髂关节炎为其特征的疾病.笔者对疑似AS患者，采用不同的实验方法进行HLA-B27检测、比较，以便为临床提供更准确的诊断依据。 1 一般材料 选择本院门诊或住院主诉腰疼、关节疼的患者120例，男56例，女64例，年龄14～56岁，平均年龄36.8岁，按不同的实验要求抽取恰当的血标本备用。 2 试剂与方法 2.1 微量淋巴细胞毒试验（MLCT） 原理：待检的淋巴细胞表面的HLA—B27抗原与已知的HLA—B27抗体结合，在补体的参入下，导致细胞膜溶解，能透过染料使细胞着色，在显微镜下判断HLA-B27为阳性，不着色为阴性。 试剂与器材： （1） 试剂：肝素抗凝剂；淋巴细胞分离液（上海试剂二厂生产）；HLA—B27 六孔抗体反应板检测板；兔补体； 染色液；固定液。 （2） 器材：10ml玻璃试管；玻璃吸管或一次性塑料吸管；离心机；冰箱；恒温箱；连续1ul加样器；连续5ul加样器；普通显微镜或倒置显微镜。 方法： （1）抽取静脉血5ml用肝素抗凝。 （2）用缓冲液将抗凝血2—3倍稀释、混匀。 （3）加于装有2ml淋巴细胞分离液试管中的液表面上。离心20分钟。 （4）吸出淋巴细胞层??另一试管，加缓冲液洗涤三次，离心2000转/分，10分钟。 （5）调细胞浓度为2.5—3.0times;106/ml。 （6）取出HLA—B27反应板，几分钟复温后，将淋巴细胞悬液加于HLA—B27反应孔，每孔1ul，放置22plusmn;2℃，30分钟。 （7）兔补体于每反应孔中加5ul，22plusmn;2℃，60分钟。 （8）加染色液5ul，5分钟后加5ul固定液固定细胞。 置室温2小时后观察结果。 结果判断： 在普通显微镜低倍视野观察反应孔中细胞。阴性：活细胞，呈圆球形，闪光，不着色。阳性：死亡细胞，扁圆形，不闪光，着色。死亡细胞率在50%以上为阳性孔，3个以上反应孔阳性者，可报告HLA—B27阳性。 2.2ELISA法测定HLA-B27 方法：样本血清101倍稀释；分别取10ul稀释样本血清和标准品（直接用）10ul分别加入反应板孔中，每孔加入100ul 酶联物，混匀，室温45分钟，馏水洗板5次；每孔加入100ul终止液混匀，5分钟后，30分钟内，酶标仪上450nm波长测定OD值，从标准曲线上查出浓度。HLA-B27lt;35U/ml为阴性, HLA-B27gt;35U/ml为阳性。 2.3流式细胞术（FCM） 流式细胞术所用HLA-B27试剂盒、溶血素及流式细胞均为BD公司产品；利用流式细胞仪对细胞进行分选，进行快速分析。流式细胞术测B27的方法是取50ul抗凝血加入1:10稀释的裂解液，去红细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，再离心弃上清，调整细胞悬液加入30ul的抗HLA-B27FITc/CD3PE，室温避光15分钟 ，上机测定，以标记阳性细胞数大于90为B27阳性。 表：MLCT、ELISA及FCM3种方法120例疑似脊柱炎患者的HLA-B27结果 3 讨论 强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一种慢性、进行性和炎性疾病,主要累及骶髂关