人胎儿来源与母体来源胎盘间充质细胞的获得与鉴定.docVIP

精品论文 参考文献 人胎儿来源与母体来源胎盘间充质细胞的获得与鉴定 刘婷 朱永朝 王立斌 马晓娜 李玉奎 魏军（宁夏医科大学附属医院宁夏人类干细胞研究所 750004） 【中图分类号】R329 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2010)35-0116-02 【摘要】 目的 分别从人胎盘组织中获得胎儿来源与母体来源的间充质细胞，并对得到的细胞进行鉴定。方法 分离纯化胎儿侧与母体侧的胎盘间充质细胞,体外扩增后进行细胞形态学比较以及PCR扩增方法鉴定细胞与胎儿和产妇本人的免疫配型。结果　成功从人胎盘中获得了分别与胎儿和产妇本人免疫配型相合的胎儿来源胎盘间充质细胞和母体来源胎盘间充质细胞。结论　本研究成功从胎盘组织中获得了胎儿来源和母体来源胎盘间充质细胞，均可以作为临床干细胞治疗的种子细胞。 【关键词】 胎盘间充质细胞 母体来源 胎儿来源 免疫分型 近年来的研究发现，胎盘中含有丰富的繁殖力极强的间充质细胞[1]，并且胎盘间充质细胞组织发育上更早期，免疫原性更弱，用来进行异体移植发生免疫排斥的可能性更低[2-6]。因而可能成为组织修复和基因治疗的新细胞来源。 本研究成功从人胎盘中获得了分别与胎儿和产妇本人免疫配型相合的胎儿来源胎盘间充质细胞（PMSCs）和母体来源胎盘间充质细胞（MPMSCs），并进行了相应的鉴定，为胎盘间充质干细胞的深入研究，以及应用于临床提供了一定的实验基础。 一、材料与方法 1. 实验材料 人足月胎盘组织样本与人外周血标本经本人签署知情同意书后，取自宁夏医科大学附属医院。 2. 实验试剂 2.1常用试剂 胎牛血清(FBS)、DispaseⅡ、Collagenase IV购自 Gibco公司，L-DMEM、Antibiotic、L-谷氨酰胺购自Invitrogen公司，基因组DNA提取试剂盒购自OMEGA公司，引物合成自上海生工。 2.2 间充质细胞培养液 含10% FBS，1% L-谷氨酰胺，1% Antibiotic的L-DMEM。 3. 实验方法 3.1 胎盘间充质细胞的获得 分别从胎盘胎儿侧和母体侧剪取1-2cm厚的组织，剪成1m3的组织块，加入 240U/mL DispaseⅡ和270U/mL Collagenase IV 在37℃水浴消化1hr后，吸取中间细胞悬液经200目滤网过滤后，以5X106/ml密度接种于细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。 3.2 胎盘间充质细胞的长期传代培养 待细胞生长至70%-80%融合时，以1：3的比例传代。重复上述操作，反复传代扩增，逐步淘汰其它细胞，从而得到较均一的间充质细胞。 3.3胎盘间充质细胞形态学观察 分别取不同代次PMSCs、MPMSCs细胞于倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化。 3.4 筛选适合宁夏地区的短串联重复序列(STR)基因座 设计STR基因座引物：GATA198B05上游引物5-GTGGAGCCAATTCACCTAAT-3，下游引物5-GAGAGACAGAACCTATAGCATGC-3 ；D10S2325上游引物5- CTCACGAAAGAAGCCTTCTG -3 ，下游引物5- GAGCTGAGAGATCACGCACT -3 ；D18S535上游引物5-TCATGTGACAAAAGCCAAC-3 ，下游引物5-AGACAGAAATATAGATGAGAATGCA -3 ；D2S1399上游引物5-CATTGGTCCAGGTAAACTGC -3 ，下游引物5-TTCACAAGGTTCCACAAGGT -3 。为了验证这四个个位点的多态性，我们随机抽取宁夏地区无亲缘关系的10人外周血DNA，用以上四对引物进行PCR扩增，产物行10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。 3.5 PCR扩增方法鉴定细胞的免疫配型 提取同一份胎盘标本PMSCs和MPMSCs细胞全基因组DNA，与抽取的该份胎盘父母双方外周血的全基因组DNA，分别进行上述四个STR基因座的PCR扩增。 二、实验结果 1. 胎盘组织形态的观察 胎儿侧胎盘组织表面分布着丰富的血管与结缔组织，颜色呈浅红色，触感较硬；母体侧胎盘组织较为松软，颜色呈暗红色。 2. 胎盘间充质细胞的培养与观察 从同一份胎盘标本中分别获得的PMSCs、MPMSCs细胞形态上未见明显差异，都呈梭形涡旋状生长，增殖速度较快。本实验室条件下原代培养两种细胞均连续传至第15代仍可保持干细胞特性（图1）。 . 图1：人