重庆大学---细胞生物学试验及研究方法.doc

研究生课程考核试卷 （适用于课程论文、提交报告） 科 目：细胞生物学实验及研究方法 教 师： 姓 名： 学 号： 专 业： 类 别： 学硕 上课时间： 年 月 至 年 月 考 生 成 绩： 卷面成绩 平时成绩 课程综合成绩 阅卷评语： 阅卷教师 (签名) 重庆大学研究生院制 重庆大学生物工程学院2013级硕士生 《细胞生物学实验及研究方法》课程考核 一、现有一液氮保存中的无限肿瘤细胞株，已知其在RPMI1640培养基中生长良好。请设计实验对其生长曲线、迁移能力等相关生物学行为进行分析。 答：实验设计如下： 因为细胞太小，无法测单个细胞的生长状况，所以要测细胞群体的生长曲线。细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。细胞生长曲线测定的方法有细胞计数法、MTT法等，此处分析无限肿瘤细胞株的生长曲线用细胞计数法。 测细胞生长曲线具体实验步骤如下： 取RPMI1640培养基中生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数（如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数）。 2．根据细胞计数结果按每个小方瓶5×104/mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。 3．24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7d。 4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。 细胞迁移能力的测定： 1、常规消化细胞，用无胎牛血清的 DMEM 培养基洗细胞 3次，配制细胞悬液，调整浓度为5×105细胞/ml，于Transwell小室的上室中加入不同的细胞悬液（MDA-MB-231/syk 、MDA-MB-231/pcDNA3.1和MDA-MB-231）200μl，每组设3个复孔。 2、下室加入600μl含50 ml/L胎牛血清的DMEM培养基。 3、37℃，5% CO2培养箱中孵育 20~24 h。 4、滤膜上的微孔允许肿瘤细胞穿越，迁移的细胞可黏附于膜下层，取出Transwell 小室，用 PBS 洗2遍，棉拭子擦去膜上面未迁移的细胞，计数并比较穿过膜的细胞数，可在一定程度上反应肿瘤细胞的迁移能力。 5、细胞显色：95%乙醇固定Transwell小室上的聚碳酸酯滤膜30min，PBS冲洗2 次，每次3 min，自来水冲洗1~21%盐酸酒精分化数秒钟，自来水冲洗1~2 min伊红染色 80 s，自来水冲洗，梯度乙醇脱水：70%乙醇 10 s，80%乙醇 10 s，90%乙醇 1 min，95%乙醇 1 min，无水乙醇 将滤膜撕下来，有细胞的一面向上放在载玻片上，加盖玻片，中性树脂封片在400倍高倍镜下记数，每张片子随机记录5个视野的迁移细胞数，将5个数值加起来表示细胞迁移数。 细胞侵袭能力的测定： 1、基质胶的准备：将冻存于-20℃冰箱的 Matrigel 胶 4℃放置过夜，变成液态。并预冷枪头。 2、用 400 μl 无胎牛血清 DMEM 培养基稀释50μl Matrigel胶原液（1:8稀释），混匀（冰上操作）。向 Transwell 小室的上室中分别加入50μl 稀释液，放入37℃培养箱中孵育4~5h，此间经常观察，当出现“白色层”时，说明 Matrigel 胶已变为固态。 3、加100μl无血清培养基浸润凝固的胶，吸弃，后续步骤与迁移实验相同。通过计数穿膜细胞数来反应细胞的侵袭能力。（还有细胞的粘附、增殖、分化等生物学行为） 二、相关研究提示间充质干细胞（MSCs）在某种刺激条件下碱性磷酸酶（ALP）的表达会发生变化。现有足够数量经过该条件刺激的MSCs和没有经过刺激的对照MSCs，请你设计实验验证该刺激条件下MSCs上ALP在mRNA和蛋白水平的表达变化。 答：经刺激的间充质干细胞（MSCs）和未被刺激的间充质干细胞（MSCs）其碱性磷酸酶的表达量发生变化。下面我将