家蚕抗菌肽Cecropin D基因的原核表达、纯化及抑菌活性测定.pdfVIP

中 国 唇 ZHONGGUOCANYE — — · 科学试验 · 家蚕抗茵肽 CecropinD基因的原核表达、纯化 及抑菌活性测定 章玉萍 牛晓利 曹玉桥 范 涛 代君君 王储言 吴传华 刘 健 (安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061； 石药集团河北中润制药有限公司，河北石家庄 050000) 摘 要 根据在家蚕品系菁松和菁松近等基因系添食家蚕浓核病病毒 (BmDNV)前后差异表达的抗菌肽 Cecropin D，构建重组表达载体pET41b-CecD，将测序正确的载体转化到E．coliBI521菌株中进行诱导表达，并对诱导条件进 行优化。诱导产物用蛋白质印迹(westernblot)进行验证。可溶性分析发现谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合抗茵肽部 分可溶，部分在表达过程中形成包涵体。GST亲和层析纯化后，分别检测重组抗菌肽的抗菌活性，结果表明：纯化 后的重组抗菌肽可以很好地抑制并杀灭细菌，其效果与抗生素卡那霉素相似。 关键词 家蚕；抗菌肽；原核表达 中图分类号 $881．2 文献标识码 A 文章编号 1007—0982(2011)o4—0020—04 家蚕病毒病 、细菌病和真菌病等主要的传染性 抑菌活性。 蚕病遍及世界各蚕区。有些家蚕品种对某一种或 1 材料与方法 几种家蚕病毒具有抗性或不感受性。如菁松对家蚕 浓核病病毒(BmDNV)敏感，菁松近等基因系表现为 1．1 试验材料 不感受性。通过利用抑制性消减杂交研究家蚕品 供试家蚕品种：黄血蚕7019(Nistari)，由中国农 系菁松和菁松近等基因系在添食家蚕浓核病病毒前 业科学院蚕业研究所提供；菌株 DH5c~、TOP10和 后基因表达的变化，检测到家蚕抗菌肽在添毒后表 BI21，表达载体pET_41b，由中国科学院上海植物生 达水平增高…。抗菌肽是一类具有光谱抗细菌、病 理生态研究所 昆虫中心实验室提供；TDNA连接 毒和真菌的较为保守的小分子蛋白 J，多带有正 酶、限制性内切酶 EcoRI、XhoI，购 自NEB公司； 电荷，同时具有亲水和疏水性2种特性。抗菌肽作 异丙基 B-D硫代半乳糖苷 (IPTG)、x—gal、ExTaq 为家蚕先天性免疫的效应分子，具有很好的抗菌活 DNA聚合酶，购 自TaKaRa公司；蛋 白质分子量标 性，并对抑制 BmNPV在家蚕体 内增殖有一定作 准、GST抗体，均购 自上海生工生物公司；RNA提取 用 J。我们通过构建抗菌肽 CecropinD重组表达载 试剂盒，购 自上海英骏公司，其它常规试剂均为国 体，表达载体导人E．coliBL21宿主菌中，经异丙基 产。 B—D硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达，再通过谷胱 1．2 方法 甘肽硫转移酶 (glutathiones2transferase，GST)亲和 I．2．I 引物设 计 CecF：5 ．GGAA TGACG 层析纯化出GST—CecropinD融合蛋 白，最后检测其 ACGACGACAAGGCTCCCGGCAACTICT]?C一3，其 中 GAATTC为EcoRI酶切位点，GACGACGACGACAAG 为肠激酶酶切位点 (为 了后期去除GST标签)。 收稿 日期：2011—06一叭；修 回日期：2011—09—15 CecR ：5 ．GGCCTCGAGCTAG唧 GTCCGAGAGCTF 资助项 目：安徽省农 业科学 院 院长青 年创新 基 金项 目(编 号