实时荧光定量RT-PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立.pdfVIP

安徽农业科学，JournalofAnhuiA ．Sci．2011，39(31)：19224—19226 责任编辑 方媛 责任校对 傅真治 实时荧光定量 RT．PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立 徐晔，段宏安 ，周毅，刘亭歧，姚燕林 (连云港出入境检验检疫局，江苏连云港222042) 摘要 [目的]建立Taqman探针荧光定量RT—PCR检测传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)的方法。[方法]选取IPNV病毒的基因保守序 列，利用PrimerExpress2．0软件设计引物与探针。以梯度稀释的含有IPNV 目的扩增片段的质粒作为标准品，探索定量RT—PCR反应条 件。[结果]当标准品浓度在 10 ～10。copies／ 之间时，标准品浓度()与 的关系为Ct=一3．426lgX+4．481，相关系数 为 0．9998。该法对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)、鲤春病毒血症病毒(SVC)和流行性造血器官 坏死病病毒(EHNV)，草鱼呼肠孤病毒(GCRV)，大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(cHsE_214)和虹鳟的核酸都没有扩增反应。I结论 l该检测方 法灵敏度高，特异性好，可用于鱼类传染性胰脏坏死病病毒的快速定量检测。 关键词 传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)；荧光定量RT．PCR；Taqman探针 中图分类号 $941 文献标识码 A 文章编号 0517—6611(2011)31—19224—03 EstablishmentofReal-TimeRT-PCRAssayforDetectionofⅡ’NV XUYeetal (LianyungangEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Lianyungang，Jiangsu222042) Abstract O『biective] eaim wastodevelopthedetectionofinfectiouspancreaticnecrosisvirus(IPNV)byreal—timeRT—PCRassay． [Method]PrimersandprobeweredesignedusingthesoftwarePrimerExpress2．0．，I1heplasmidcontainingthetargetsequencewasconstruc— tedtodetecttllesensitivityandpreparethestandardcurve．Thestandardcurvewasprepraedbasedonthelinearrelationshipbetween thea— mountofplasmidDNAandcyclethreshold (Ct)． 『ResuhlThelinearrelationshipbetweenvirusconcentration ()andCtwasCt= 一 3．0696+42．246 (R =0．9998)．ThemethodwasspecificforIPNVanddidnotreactwihtohtercomparativefishvirusandnucleicacid ofrainbowtrout． C『onclusion1ThedeterminationofIPNVbyreal—timeRT—PCRwithhighsensitivityandspecificitywasaneffectivetoolofrthe rap-iddetectionofIPNV． Keywords Infectiouspancreaticnecrosisvirus(IPNV)；RealtimeRT—PCR；Taqmanprobe 传染性胰脏坏死病(Infectiouspancreaticnecrosis，IPN)主 保存。 要危害溪鳟、虹鳟、银大麻哈鱼的鱼苗，急性传染，死亡率达 1．1．2 主要试剂和仪器。AMV反转录酶等反转录试剂、Taq 70％～80％，是一种严重的传染性疾病 。IPN最早在北美 DNA聚合酶购 自上海生工生物公司，ABI7300型荧光 PCR 和欧洲国家流行，于加 世纪80年代传人朝鲜、中国台湾省 定量检测仪 (美国应用生物系统公司)，GeneQuantpro核酸 及东北、山西、山东、甘肃等地，是鱼类进 出口检疫的重要检 浓度测定仪(美