生物工程（中国药科大学）.ppt

1982年世界上第一个基因工程药物药物诞生了，由美国Lilly公司率先研制的重组人胰岛素经美国FDA批准投放市场，这标志着生物制药技术进入了一个新纪元，也给广大的制药企业带来了无限的商机。同时也向世人展示，以基因工程技术为核心的现代生物技术药物具有无限的发展应用前景和生命力。 生物技术药物在临床上的应用 生物技术药物(biotech drugs，biopharmaceuticals）己广泛用于治疗癌症、艾滋病、冠心病、多发性硬化症、贫血、发育不良、糖尿病、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传疾病。 生物技术药物的类别 主要有三大类： 1、重组治疗蛋白质（酶、细胞因子、激素） 2、重组疫苗 3、诊断或治疗用的单克隆抗体或基因工程抗体。 第二章 基因工程与蛋白质工程 基因工程是指在分子水平上按照人们的设计方案将DNA片段（目的基因）插入载体DNA分子（如质粒、病毒等），从而实现DNA分子体外重组，产生新的自然界从未有过的重组DNA分子，然后再将之引入特定的宿主细胞进行扩增和表达，使宿主细胞获得新的遗传性状的技术。基因工程有时也称为重组DNA技术或分子克隆技术。 Genetic Codon 一、基因工程的概念及其基本过程 典型的主要步骤有： 1、? 目的基因(靶基因)的制备； 2、? 载体的选择与制备； 3、? 目的基因与载体的连接； 4、? 将重组DNA分子转入宿主细胞，并 在其中进行复制、扩增； 5、? 重组子的筛选与鉴定； 6、? 表达产物的鉴定； 7、? 工程菌（细胞）的大规模培养； 8、? 表达产物的分离与纯化。 Cloning into a plasmid Expression of a eukaryotic protein in E. coli t-PA分子的一级结构 要进行蛋白质分子设计，必须具备三个基本条件。 首先，必须从总体上对蛋白质分子的理化性质、结构功能有一个基本了解，具有蛋白质分子构象规律的基本知识。 其次，必须具备进行分子设计的基本工具，具体说来，就是高性能的计算机硬件和功能齐全的计算机软件; 第三，必须熟悉所研究的具体对象，即对需要进行改造的蛋白质分子必须有一个系统、全面和深入的了解。在此基础上，才可以应用蛋白质分子预测技术提出合理的设计方案。 然而，蛋白质分子设计只是为有目的的蛋白质工程实施提供设计方案，无论进行怎样的合理分子设计，要进行实施并验证设计的正确性，还必须依赖DNA重组技术，其中包括基因的分离、克隆、突变与表达。与一般的基因重组技术不同的是，这里所用的目的基因是经过定点或非定点突变过的突变基因，所表达出来的蛋白是突变蛋白，这也就是蛋白质工程技术被称为第二代基因工程的道理所在。由此可见基因突变技术是蛋白质工程实施过程中不可缺少的更要工具。 概括而言，整个蛋白质工程的基本过程分为以下几个步骤： 第一，首先要分离纯化得到所需改造的目的蛋白； 第二，对已分离纯化的蛋白进行氨基酸序列测定以及X射线晶体衍射分祈、核磁共振分析等一系列分析测试，尽可能多地获得该蛋白结构和功能信息； 第三，根据该蛋白质分子的结构功能信息以及相关蛋白的生物信息学信息，运用蛋白质分子预测技术提出蛋白质设计方案； 第四，分离克隆该蛋白的编码基因，并应用基因定点诱变对该基因进行突变改造； 第五，将突变改造的基因片段插入适当的表达载体，并加以表达； 第六，分离、纯化表达产物并对其进行生物学功能检测。 蛋白质结构测定 1. 一级结构测定 蛋白质一级结构的测定又称蛋白质顺序分析，其基本方法是：（1）应用化学裂解法和蛋白酶水解法将多肽链专一性裂解；（2）逐一测定每个纯化的小肽段的顺序；（3）根据肽段氨基酸顺序中的重叠区确定小肽段的排列次序；（4）完成整条多肽链的顺序分析。 尽管蛋白质顺序分析已经自动化，但仍然耗时、复杂并且昂贵。重组DNA技术出现后，人们可以从cDNA或基因序列直接推导出蛋白质的氨基酸顺序，速度快且经济，已成为最常用的测定蛋白质一级结构的方法。 2. 蛋白质三维结构测定 根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两大类：（1）应用X射线晶体衍射图谱法（X-ray crystallography）和中子衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象；（2）应用核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）、园二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质构象。 利用X射线晶体衍射法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相