How to get siRNA RNAi课题.ppt

Then how to get siRNA? siRNA制备方法 A. 化学合成法 方法简单、快速，需要时间短；获得的siRNA纯度高 适用于短期体外实验研究，尤其适用于需要单一siRNA序列的研究 siRNA可进行标记 需要进行大规模的筛选来确定单一的siRNA序列 不适用于长期研究 不适用于siRNA序列的筛选 siRNA序列设计注意事项 选择以AA开头的19-21nt长的序列 靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始，到终止密码子上游75-100nt处结束 选择 2-4个靶定序列，以筛选特异性最好的进行实验 选择的序列中 GC含量在 30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出现3 个以上G。 若需要发卡结构，发卡部分长度一般为6-9nt，有文献报道9nt效果较好. 最后,选择的DNA 片段经BLAST 查询,应与其它人类基因无同源性 设定适当的对照 设置适当的siRNA对照 1) 与靶定siRNA有相同的碱基组成，但排列完全不同，且不与其它基因由同源性 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6) ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6) 2)1-2碱基错配的 siRNA对照 (1-2nt) AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG T 和 A错配 siRNA序列设计 B、体外转录合成短的siRNA T7 RNA 聚和酶体外转录DNA，直接产生小片断的siRNA， 快速、灵活，适用于siRNA序列的筛选以及化学合成siRNA价格昂贵时 siRNA可进行标记 可重复性差，不适用于长期研究和需要大量单一siRNA序列的研究 C、 使用Dicer酶切长片断dsRNA产生siRNA 使用T7RNA聚和酶体外转录,产生长片断的dsRNA，然后使用Dicer酶消化，产生短的siRNA 产生的为siRNA的混合物，因此沉默效果较好 该方法方便、简单、需要时间短，容易操作适用于快速而便宜的表型功能缺失研究 可对产生的siRNA进行标记 不适用于长期研究和需要确定的单一siRNA的研究 可能产生非特异性的基因沉默 D1、质粒载体合成siRNA（非病毒） 首先合成具有发卡结构的DNA，构建到含有U6 或者H1 启动子的质粒中，质粒转入细胞，在启动子操纵下转录生成siRNA; 该方法可在胞内持续产生siRNA，适用于长期研究; 价格较贵，构建过程相对复杂，只适用于体外研究 D2、病毒载体合成siRNA siRNA在病毒骨架上进行转录，适用于原代细胞、可进行体内和体外实验；有可能进行稳定转染 使用腺病毒载体：可进行体内实验，转染效率高 使用逆转录病毒载体：可进行整合，导致稳定转染 构建过程复杂，成功率相对较低，而且具有安全隐患 E、PCR方法构建siRNA表达元件（SEC) PCR方法构建含有特定启动子和终止子以及靶定DNA序列的表达元件 转染到胞内后，在启动子操纵下，siRNA表达 方法简单，无需构建载体； 适用于siRNA序列筛选，及载体克隆前启动子的筛选 不适用于长期研究 常用的发卡结构中Loop环的长度和序列 RNAi 技术的应用: 基因治疗 RNA干扰最初的研究多局限于植物、线虫和果蝇等的研究.对哺乳动物的研究则是在最近几年,对其发生机制有了初步了解后才开始的. RNA干扰技术在实验动物体内的研究目前在国内还鲜有报道,在国外也不多见.目前的研究多局限于细胞水平.如何将siRNA安全有效地导入动物体内,即载体的选择,是制约RNA干扰技术在实验动物体内应用的瓶颈之一.但RNAi诱人的应用前景仍吸引着许多科学家, 研究小组,实验室以及国际知名的生物公司投入到这放方面的研究. 如Brummelkamp 等建立了突变体K-ras V12 的siRNA 表达系统pSUPER-K-ras V12 ,通过转染人胰腺癌CAPAN-1 细胞系,观察其抑制内源K-ras V12 的表达,结果显示pSUPER-K-ras V12能显著降低K-ras V12的mRNA 表达水平,而对照组cyclin D1 的表达水平没有影响;构建突变体K-ras V12 的siRNA病毒载体转染CAPAN-1 细胞能明显抑制细胞克隆的生长,以及阻止裸鼠肿瘤的形成,而对照组细胞生长良好并产生克隆,体内裸鼠实验5周内均长出肿瘤,因此证明了siRNA 具有明显的特异性和抑制肿瘤生长作用,为肿瘤研究提供了新的技术方案[21] 。 Wilda 等[22 ] 设计了M-BCR-ABL 融合蛋白的dsRNA ,通过转染白