环境微生物学 微生物的生长与代谢-2.ppt

环境微生物学 环境与公共卫生学院 第3章 微生物的生长与代谢 第三节 环境微生物的生长繁殖 微生物纯培养技术 微生物的生长繁殖 无菌技术 　分离、纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术，它是保证微生物学研究正常进行的关键。 接种操作 用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。 由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。 用固体培养基分离纯培养 不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。 大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。 所谓平板，即培养平板(culture plate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。 固体培养方法可将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。 固体培养基(用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基)，可使每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。 最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。 Koch建立的平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1.稀释倒平板法待分离的材料用无菌水作一系列的稀释，取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间，可能出现在平板表面或琼脂培养基中的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。 随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 2.涂布平板法 在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。 3.平板划线分离法 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 单细胞(单孢子)分离 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞(单孢子)分离法。 单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。 单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。 通过分离纯化得到的微生物纯培养物，必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。 菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作，微生物菌种是珍贵的自然资源，具有重要意义。 传代培养保藏 常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。 选择使用适宜的培养基，并在规定的时间内进行移种。 传代培养十分繁琐，容易污染，特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退，使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化 。 微生物生长繁殖 微生物生长是细胞物质有规律地、不可逆增加，导致细胞体积扩大的生物学过程，这是个体生长的定义。 繁殖是微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 在一定时间和条件下细胞数量的增加，这是微生物群体生长的定义。 细菌的个体生长 细菌的个体生长包括细胞结构的复制与再生、细胞的分裂与控制： 染色体DNA的复制和分离 细胞壁扩增 细菌的分裂 细菌的群体生长繁殖细菌接种到均匀的液体培养基后，在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间里细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线。 直接计数这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×l000×稀释倍数