影响牛PCR胚胎性别鉴定反应率的因素分析研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术．研讨会论文集 影响牛PCR胚胎性别鉴定反应率的因素分析 金方1房义2余文莉1’2李树静1’2 1、北京安伯胚胎生物技术中心1001072、河北农业大学动物科技学院071001 摘 要：本研究对影响牛PCR胚胎性别鉴定反应率的因素进行了分析，以期提高胚胎性别鉴定效 率。结果表明取样时样品中加入透明带残片使PCR反应率显著降低；取样大于等于5个细胞组PCR 反应率显著高于取样1～4个细胞组；取样为死细胞和散细胞组的反应率略高于取样为活细胞组，但 二者无显著差异；胚胎质量对反应率无显著影响；桑椹胚和早期囊胚的反应率显著低于囊胚和扩张 囊胚，囊胚和扩张囊胚之间差异不显著。 关键词：牛PCR胚胎}生别鉴定反应率 自从Herr等首次用PCR技术扩增牛Y染色体特异性系列经电泳对牛胚胎进行了性别鉴定成功后， PCR方法胚胎性别鉴定技术成为了世界上最流行的胚胎性别鉴定方法u一。。但是成功的方法并不一定 能产生成功的结果。在奶牛胚胎性别鉴定技术商业化运作中，其效益的发挥受到反应率、准确率和 移植妊娠率等诸多因素的影响。本文以提高胚胎性别反应率为目的，分析透明带残片、取样大小、 细胞活性、胚胎发育阶段和胚胎质量等对PCR反应率的影响，从而选取适宜的样品，即可获得理想的 反应率又能保证可接受的妊娠率。通过对不同质量级别胚胎的鉴定以期提高胚胎的利用率。 1．材料和方法 1．1材料 1．1．1胚胎取自超排发情后7～7．5天的高产荷斯坦奶牛。胚胎发育阶段：紧缩桑椹胚、早期囊胚、 囊胚和扩张囊胚。胚胎质量：1、2、3级。 1．1．2主要仪器 POLAROID照相系统 DICKINSON WA)、2la lal通用吸头(AB 公司)、显微分割刀(AB l取样吸头和200 Technology,Inc，Pullman la WA)、100 1离心管、胚胎分割液(SPLITTING，ABTechnology)、胚胎回 Technology,Inc，Pullman 收液(RETRIVAL，AB 雌性和雄性扩增对照样品(AB Technology和自制) 1．2方法 冷冻前保存在HOLDING液中。 1．2．2胚胎取样将胚胎分割仪与倒置显微镜固定在一起，将一特制的显微分割刀固定在显微操作 行分割取样。理想的情况下，在桑椹胚的边缘或囊胚的滋养层切取由5—6个细胞组成的小块。每个 lal离心管中。 取样吸头，吸取2ul的回收液从分割液滴中将样品吸起，推入装有8ul超纯水的100 样品取走后，用200ul通用吸头吸取50ul回收液，从分割液滴中将取样后的胚胎吸起，放入6孔平 皿对应的HOLDING液滴中准备移植或冷冻。 1．2．3 性温度95℃，延伸温度72。C，退火温度64。C，经过30个循环65min进行DNA扩增。 39 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 电压的琼脂糖凝胶板上运行15—20min。 1．2．5结果分析如样品出现三条电泳带，即雌雄共有的常染色体基因片段、Y一染色体上相应片段 和“引物带”，即为雄性胚胎；只出现两条带，即雌雄共有的常染色体基因片段和“引物带”，即为 雌性胚胎。如样品只出现“引物带”或无带，即为没反应(NR)。 1．2．6统计分析采用X2检验。 2．结果 2．1取样情况对牛PCR胚胎性别鉴定反应率的影响分析 胚胎取样情况是影响PCR胚胎性别鉴定反应率的重要因素之一。取样时样品极易粘到切下的透明 带残片上，透明带中经常有残留的精子。剥离透明带时常因样品粘到吸头上而使样品丢失或影响取 样速度，而将透明带残片与样品一起加入反应管中是否会影响鉴定结果的雌雄比例和反应