大鼠糖皮质激素受体基因Ad5F35型腺病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

·基础研究· 大鼠糖皮质激素受体基因Ad5／F35型 腺病毒载体的构建与鉴定 王涛1’2。邢昌赢2。袁自静1，钱军2，赵秀芬2，朱江1 (1南京市江宁医院，南京211100；2南京医科大学第一附属医院) Neo- 摘要：目的构建大鼠糖皮质激素受体(GR)基因到Ad5／F35型腺病毒载体并鉴定。方法将pcDNAl Rat GR GR的质粒经酶切获得RatcDNA酶切片段，与载体质粒pDC316的酶切片段一同转染到感受态大肠杆菌 大鼠GR的重组腺病毒，氯化铯梯度离心纯化最终获得2．8×10“PFU／mL滴度的重组病毒。结论成功构建了大 鼠GR的高滴度重组腺病毒。 关键词：糖皮质激素受体；腺病毒；载体；转染；大鼠 doi：10．3969／1．issn．1002-266X．2013．32．008 中图分类号：R318．16文献标志码：A 文章编号：1002-266X(2013)32-0025-03 糖皮质激素(GC)被广泛用于治疗各种原发性 肾小球疾病和系统性自身免疫性疾病¨’21，具有降 vitrogen公司，BamHI限制酶、BgⅡ限制酶、10× Buffer X DNA 低尿蛋白的作用。GC通过弥散作用进入细胞，与 H、10×BufferM、6 Buffer、T4 Loading 糖皮质激素受体(GR)结合，形成GC．GR复合体；在连接酶Buffer、T4 15000 2000 11 MAPK的作用下磷酸化，进入细胞核，与DNA上的 marker、Sac marker、DL I限制酶、Bgl 糖皮质激素受体结合单元(GRE)结合，发挥基因调 控作用，如抑制炎症介质和细胞因子的表达旧4J。 盒、DNA凝胶提取试剂盒购自V—gene公司，感受态 合理使用GC可以发挥长期的肾脏保护作用，但长 期大剂量、甚至中小剂量应用GC会产生明显的不 京)有限公司。 良反应，同时会导致GR下调，造成GC作用不敏感，1．2方法‘71 GR表达水平低者则表现为激素抵抗∞’6o。如果能 够增加体内局部GR的表达，使GC在体内的作用靶 Neo．Rat 始质粒：取pcDNAl GR质粒，热休克法转化 点增多，形成更多的GR．GC复合体，则可以使GR 人感受态大肠杆菌BL21；次日挑取单克隆，接入LB 更好地发挥作用。2011年6月一2012年1月，我们 培养基，37℃振荡培养18h，取菌液提取质粒。目 构建大鼠GR基因到Ad5／F35型腺病毒载体并进行 的基因GR片段的酶切：按照比例分别取GR质粒、 鉴定。现报告如下。 BamH I限制酶、10×BufferK、H20，总体积40汕， 1材料与方法 37℃水浴酶切过夜。载体质粒pDC316的酶切：按 Neo．Rat GR由美国亚利 1．1材料