喉癌细胞株HEP-2中叶酸受体表达的实验研究.docVIP

精品论文 参考文献 喉癌细胞株HEP-2中叶酸受体表达的实验研究 陈燕1 熊正宁1 陈鸿雁2(1荣县人民医院 四川荣县 643100；2重庆医科大学附属第一医院 400016) 【中图分类号】R965 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)26-0220-02 【摘要】 目的 探讨喉癌细胞株HEP-2中叶酸受体的表达情况。方法 以PBS液作为空白对照，采用免疫组化法对分别检测alpha;型叶酸受体及beta;型叶酸受体在喉癌细胞株HEP-2中的表达情况。结果 喉癌细胞株HEP-2特异性高水平的表达alpha;型叶酸受体，非beta;型叶酸受体。结论 叶酸受体有望成为治疗喉癌治疗的一个新靶点，值得进一步探索。 【关键词】 叶酸受体 喉癌细胞株HEP-2 喉癌给人类造成了重大的危害，长期以来研究怎样早期诊断及治疗喉癌一直是医学上的研究热点，除了常用的药物化疗、放射治疗和手术治疗之外，各种新的方法不断出现，如免疫疗法、光动力疗法和基因治疗法等，光动力疗法是根据卟啉衍生物的光敏特性，把它们注入体内，利用光照下产生的氧自由基Ⅸ破坏癌细胞组织，以杀死癌细胞，但存在杀伤效率较低，选择性差等问题.常用的药物疗法、放射疗法也会伤害癌细胞周围的正常细胞，造成有害影响，近年来靶向技术因其能减轻对正常细胞的危害而受到广泛重视，本研究为喉癌的靶向治疗提供可能的实验依据。 1 材料和方法 1.1材料和仪器 喉癌细胞株HEP-2由本实验室常规保存。alpha;型叶酸受体单抗(MOV-18)购于晶美生物工程有限公司，beta;型叶酸受体单抗获赠于日本鹿儿大学，SP-9000免疫组化试剂盒购于北京中杉生物有限公司。 1.2 实验方法 细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存管，置于37℃水浴箱中，轻轻摇动使细胞在1min内解冻。将细胞悬液转入离心管中，加入6ml RPMI-1640培养基，离心800rpm/min后去上清。加入2ml RPMI-1640培养基重悬细胞，转入培养瓶中，另加入6ml RPMI-1640培养基置CO2孵箱中培养。 细胞培养：喉癌细胞株HEP-2用含10%新生小牛血清RPMI-1640培养基培养，于37℃、含有5％CO2培养箱中培养传代，选用对数生长期细胞实验。 免疫组化染色：将喉癌细胞爬片固定，热修复处理后，以PBS液代替一抗作为空白对照组，分别以alpha;型叶酸受体及beta;型叶酸受体单抗作为一抗进行细胞免疫组化染色(SP)法，具体方案参照SP-9000型试剂盒说明书。 1.3 结果判断标准[1] 以细胞膜上呈现棕黄色染色为阳性结果，强阳性为阳性率gt;90％, 阳性为50％-90％,弱阳性为10％-50％，阴性者lt;10％；以阳性积分光密度(OD)除以面积，取平均值间接反应该标本FRs表达阳性率情况。 2 结果 细胞免疫组化染色结果显示，MOV-18组(alpha;-FR组)喉癌细胞膜上均呈现棕黄色染色(见下图)，阳性率90％，为强阳性(gt;75％)，beta;型叶酸受体单抗组及空白对照组无着色。说明喉癌细胞膜上高水平表达alpha;-FR。 3 讨论 本实验研究发现：喉癌细胞株HEP-2细胞膜上表达alpha;型叶酸受体，表达的阳性率90％，而不表达beta;型叶酸受体，说明喉癌细胞株HEP-2中特异性的表达alpha;型叶酸受体。 在头颈肿瘤中，Antony Ac[2]等发现，叶酸受体定位于11q13.3-14.1,此位点邻近Int2,而Int2位点为大鼠乳腺肿瘤的病毒螯合位点的人类同源系列。Weitman SD等[3]发现，叶酸受体编码区域在20%的头颈肿瘤中有扩增。此外,该基因是Bcl-1易位基因t(11;14) (q13;q32)的一个重要位点。此位点包括编码几种生长因子.可能还有细胞周期蛋白的基因.这些基因的表达可能是细胞的转化有关。说明叶酸受体与头颈肿瘤的发生有一定的关系。众所周知，在生理条件下，人体内所需的叶酸必须从外界环境中摄取，而叶酸末端的两个羧基是很难自由通过细胞膜的，为绕过这个屏障，生物体引入了两种机制，一是利用低亲和力的跨膜蛋白直接将叶酸转入胞浆，另一种就是通过高亲和力的糖蛋白受体，即是叶酸受体，通过细胞的内吞作用，将叶酸以氧化物的形式转入细胞内，也是介导叶酸进入细胞的主要途径。首先，叶酸与其靶细胞特异的膜表面受体结合，并富集在靶细胞特定区域(包涵体有衣小凹处)，该区域向胞浆内陷形成胞内体，在酸性(pH5.0