RNA的定量测定.pptVIP

实验九 RNA含量的测定(苔黑酚法）Exp.9 Quantitative Determination of RNA by the Orcinol Reaction  核酸含量测定方法 紫外吸收法 定磷法 琼脂糖凝胶电泳法 定糖法 测糖法 RNA含有核糖，DNA含有脱氧核糖，二种糖有不同的颜色反应，经过呈色反应后，所呈现的颜色深浅在一定范围内与样品中所含的糖量成正比。由于常用的测糖法只能测定核酸中与嘌呤相连接的糖，而不同来源的核酸含嘌呤、嘧啶的比例各不相同，故把测定的糖量来统一换算成核酸的含量很不正确。一般要求用与被测核酸同一来源的纯核酸作标准曲线，通过标准曲线再查出被测样品的核酸含量，这样可以把误差减到最小。 DNA定量测定 DNA酸解后生成嘧啶核苷酸、嘌呤、磷酸和脱氧 核糖。脱氧核糖在酸性条件下脱水生成ω-羟基-γ-酮 基戊醛，它能与二苯胺反应生成蓝色复合物，其最大 光吸收在595nm，可用比色法测定。样品中DNA浓度 在50～500μg/ml范围内，其光密度值与DNA含量成正 比。样品中若有少量RNA对测定结果影响不大，但镁 盐、蛋白质、多糖及其衍生物、芳香醛对测定有干 扰。 RNA定量测定 一、实验原理 当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解生成嘌呤碱基、核糖和嘧啶核苷酸，RNA分子中的核糖基转变成α-呋喃甲醛，后者与3，5-二羟基甲苯（苔黑酚）反应，在高铁离子的催化下可反应生成绿色物，反应产物在670nm处有最大吸收。在10～100μg/ml范围内其光密度值与RNA浓度有线形关系，可用比色法测定。样品中有蛋白质或粘多糖或大量DNA时对测定有干扰。其中蛋白质可用5%三氯乙酸沉淀后再行测定。有大量DNA存在时，加入适量的CuCl2·H2O可减少DNA的干扰 。 3、仪器设备 分光光度计（测定时所用的） 试管7支 1.5cm×15cm 吸管8支（0.50ml 2支，1.0ml 3支， 2.0ml 3支） 恒温水浴锅 三、方法和步骤 1. 标准曲线的绘制 取试管6支，按下表(表1)操作。 试管 0 1 2 3 4 5 标准RNA/ml 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 RNA量/（mg/ml） 0 40 80 120 160 200 蒸馏水/ml 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 苔黑酚试剂/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 混合均匀后，置沸水浴中加热45min，冷却，在670nm波长处比色 A670nm 表.1 RNA 标准曲线的制作过程 2. 样品的测定 取待测样品1.0ml，加蒸馏水1.0ml及苔黑酚试剂2.0ml，沸水浴保温45min，冷却，然后在670nm波长出测定光密度值。 四、实验结果 根据测待测样品光密度值，从标准曲线上查得相应的RNA的mg数，按下式计算待测样品的RNA的含量。 w =（m1 /m2）×100% W: RNA的质量百分数（%）；m1：样液中测得的RNA的质量（mg） m2：样液中样品的质量（mg）  五、思考题 1、 RNA含量测定的方法有哪些？各有何优缺点？ 2 、简述苔黑酚法测RNA的基本原理。  六、参考文献 1.生物化学实验原理和方法,李建武等编,北京大学出版社 1994年 2.The tools of Biochemistry,Terrance G,Cooper,1977 3.生物化学实验,陈钧辉等编,3版或4版 科学出版社2003 设备初始化 测量主界面 光度测量界面 波长设置 参 数 设 置 样品测量 测 量 主 菜 单 样 品 测 量 * * * * * * *