中药青蒿的代谢工程.ppt

中药青蒿的代谢工程 Artemisia annua (青蒿) 青蒿素 (Artemisinin) 目的意义 用途： 抗疟疾：青蒿素是世界卫生组织(WHO)推荐的目前最有效的疟疾治疗药物。 基于青蒿素的综合疗法(artemisinin-based combination therapies, ACTs)现在已经成为WHO推荐的疟疾治疗一线药物. * 2011年9月12日，中国科学家屠呦呦获得2011年度拉斯克奖(Lasker Award) “临床医学奖”。获奖理由是“因为发现青蒿素——一种用于治疗疟疾的药物，挽救了全球特别是发展中国家的数百万人的生命”。这也是至今为止，中国生物医学界获得的世界级最高大奖。 * 全球疟疾感染者分布图：每年有5亿人感染疟疾，其中有近100万人不幸死亡。 * 青蒿的资源分布 青蒿(Artemisia annua L.)，其分类学上中文学名为黄花蒿, 属于菊科(Compositae)蒿属(Artemisia)一年生草本植物。 黄花蒿 (Artemisia annua L.) * artemisinin IPP Proposed biosynthetic pathway of artemisinin ADH1 ADS CYP71AV1 CYP71AV1 CYP71AV1 Dbr2 ALDH1 ALDH1 FPS Steriods Other sesquterpenes ？ * × × other sesquterpenes SQS triterpenes FPS ADS 青蒿素生物合成途径及调控策略示意图 squalene SES FPP “开源” “节流” * 1.相关基因的挖掘 2.高效遗传转化系统 3.青蒿再生体系建立 青蒿代谢工程的关键环节 * 青蒿素生物合成的位点 A. annua is the only natural source of artemisinin; however, its content in plants is relatively low (0.1–0.8% by dry weight). * 青蒿腺毛cDNA文库的构建及青蒿素生物合成相关基因的克隆 关键酶基因 候选基因 * 1983年，贺锡纯等首次报道以青蒿的嫩茎和嫩叶为外植体，诱导出愈伤组织，愈伤组织经继代转接后可形成幼苗。 青蒿的组织培养 青蒿素的紫外吸收曲线 a. 标准品 b. 带分化芽的愈伤组织 天然植株和再生植株青蒿素含量的紫外吸收曲线 a. 天然植株 b.再生植株 * 青蒿发根遗传转化系统的建立 转基因青蒿发根 * 青蒿丛生芽遗传转化系统的建立 GFP expression in the leaf of transgenic plants. A. leaf of untransformed plant; B. leaf of transgenic plant. Transgenic plantlets Sequences between T-DNA right border (RB) and left border (LB). The NPTⅡgene is used as a selectable Kan-resistant plant cells. Arrows indicate the reaction sites of SmaⅠ, SacⅠand Hind Ⅲ. Nos/p NPTⅡ Nos/t CaMV35S/p gfp coding seq. Nos/t RB LB Hind Ⅲ Sma Ⅰ Sac Ⅰ * 异源法呢基焦磷酸合酶(FPS)对青蒿发根中 青蒿素生物合成的调控 Acetyl-CoA HMG-CoA MVA IPP FPP Artemisinin FPS 转基因发根的Southern检测 转基因发根的Northern检测 pBIFDS植物表达载体的构建 转基因发根青蒿素含量检测 转基因青蒿发根 * 异源法呢基焦磷酸合酶(FPS)对青蒿素生物合成的调控 转基因青蒿植株 转基因植株的Southern检测 转基因植株青蒿素含量检测 Acetyl-CoA HMG-CoA MVA IPP FPP Artemisinin FPS pBIFDS植物表达载体的构建 转基因植株的Northern检测 * 内源法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因 对青蒿素生物合成的调控 分子量标准 B. 细胞全蛋白 C. 硫酸铵分级沉淀 D. Q-epharose纯化 29KDa 97KDa 68KDa 43KDa 18KDa A B C D 不同方法纯化的蛋白 AaFPS1的Michaelis-Menton * 转FPS基因