胰岛素复合物INSLTMC口服降糖效果研究及LTMC对胰蛋白酶活性的影响研究.pdf

胰岛素复合物0NS．LTMC)1：]J]艮糖效果研究及 LTMC对胰蛋白酶活性的影响 任慧霞张建国 山东大学药学院生化与生物药物研究所济南25 0 0 l 2 摘要 目的研究INS—LTMC经口服给药后的降糖效果，并在体外研究了LTMC 对胰蛋白酶活性的影响，以确定LTMC保护INS的作用机制。方法小鼠分别 服INS对照组的降糖效果；另外，通过测定胰蛋白酶的效价，研究了不同浓度 LTMC对胰蛋白酶活性的影响。结果口服INS．LTMC组的降糖效果，与对照组 比较，具有非常显著性差异但O．001)，60分钟后血糖值下降达到21．03％±6．57％； 另外，研究发现LTMC对胰蛋白酶的活性并无抑制作用。结论本试验证实INS 经修饰后在胃肠内的稳定性显著增加，口服后具有显著的降糖效果；另外，通过 胰蛋白酶效价测定可推断，LTMC对INS的保护作用不是通过抑制胰蛋白酶的活 性而实现的，其作用机制可能是通过减少胰蛋白酶与INS的接触而发挥保护作 用。 1材料 1．1试剂 苯甲酰一L一精氨酸乙酯盐酸盐(中国医药集团上海化学试剂公司，批号： ；葡萄糖氧化酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)：其他试剂均为分 析纯。 1．2仪器 度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；离心机(上海分析仪器厂)；恒温水浴箱(北 京市西城区医疗器械厂)；SPSS12．0(SPSSInc．)。 1．3动物 小白鼠，昆明种，山东大学试验动物中心提供。 2方法和结果 ≥弦 2．1 INS—LTMC修饰物口服降糖效果研究 2．1．1INS—LTMC和INS溶液的配制 制成每lml中含INSIOU的溶液，然后置冰箱中冷藏储存，备用，8小时内使用。 2．1．2实验动物分组 健康昆明小鼠30只，体重均为209±29，随机分为3组，第1组为试验组， 小鼠灌胃给予INS—LTMC的氯化钠溶液；第2组为试验对照组，小鼠灌胃给予相 同浓度和体积的INS氯化钠溶液；第3组为空白对照组，小鼠灌胃给予相同体积 的pH2．5氯化钠注射液。 2．1．3给药方法 氯化钠溶液，试验对照组口服灌胃给予相同浓度和体积的INS氯化钠溶液，空白 对照组口服灌胃给予相同体积的pH2．5氯化钠溶液。 2．1．4血糖测定及降糖效果测定 分别于给药前和给药后60分钟在小鼠眼静脉丛取血，分别置于塑料离心管 u 中，以4000r·min。1离心lOmin，取血浆251，采用葡萄糖氧化酶法测定血糖 值，并计算血糖下降百分率。 2．1．5数据处理 利用统计软件SPSSl2．0对数据进行处理，通过t检验比较各组间是否存在 显著性差异，P(O．05说明有显著性差异。结果见表1。 表1小鼠口服INS—LTMC、INS后血糖下降百分率％(一X土s，n=lO) 组别 60分钟后血糖下降百分率(％) 空白对照组 5．76±7．08 试验对照组 10．08±7．28 试验组 21．03±6．57+ 注：与空白对照组、试验对照组比较，}尸0．001 结果表明，试验对照组，即口服INS组与空白对照组比较，降糖效果无显著 性差异(只0．05)，说明INS口服后，在胃肠道内大部分己被破坏，无明显的降糖 效果。13服INS—LTMC组与空白组和试验对照组比较，降血糖效果均有非常显著 性差异(P0．001)，说明经修饰后的INS—LTMC具有显著的降糖效果，能够有效抵 抗胃肠道内酶对INS的破坏。 2．2不同浓度LTMC对胰蛋白酶活性的影响 参照中国药典2000年版[1]，胰蛋白酶的效价测定方法测定LTMC对胰蛋白 酶活性的影响。 2．2．1底物溶液的配备 精密称取N一苯甲酰一L一精氨酸乙酯盐酸盐42．8mg，置于50ml容量瓶中，加 水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为底物原液：精密量取5ml，置于50ml容量瓶 中，用磷酸盐缓冲液CK 氢二钠溶液87ml混合，pH值