膜蛋白质组学研究中样品制备与净化方法的发展与应用研究.pdfVIP

膜蛋白质组学研究中样品制备与净化方法 的发展与应用 and of applicationsample Development and inthe cleanupstrategies preparation ofamembrane analyses proteome 指导教师姓名、职称 至竖丝塾撞 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一一年五月 ■■■●—●，■■■1 ll I——I li II TIIIlIIIIlIIIHIIIlII- II IIII ■誓■■—————■■■■■■■■—■———一Illlml FI—III—II II- liltr !ffIIIIII l llllII III Y191 2430 摘 要 膜蛋白质在许多生命活动过程中发挥着重要的作用，包括细胞与 环境之间的物质和能量交换以及信号转导等。然而，目前对于膜蛋白 的研究仍然面临很大的挑战，这主要是因为膜蛋白大多具有低丰度和 强疏水性的特点，从而给这些蛋白质的溶解、提取和酶解带来困难。 为了解决这些问题，通常会在膜片的水平上对膜蛋白质进行富集，并 且通过加入一些高浓度的添加剂(如去垢剂和有机溶剂等)来促进膜 蛋白质的抽提和溶解。SDS是最有效、最经典的去垢剂。但是，由于 SDS台g够降低蛋白酶的活力，影响酶解产物的色谱分离和抑制质谱分 析时的肽段的解离，所以，必须设法在酶解等后续实验步骤之前对样 品进行净化处理，以除去样品中的SDS及其他干扰物质。传统的样品 净化策略主要有沉淀法、透析、离子交换以及凝胶过滤等，尽管这些 方法都能在一定程度上除去样品中的小分子干扰物质，但它们都有一 个共同的缺陷，即在样品净化过程中往往导致明显的蛋白的损失，此 外，这些方法还在蛋白质鉴定效果和实验成本等方面存在一定的局限 性。在本研究中，我们针对现有方法的缺陷展开研究，发展了基于凝 胶电泳和预冷丙酮沉淀的样品制备和净化方法并将其应用于膜蛋白 质组学研究。 在基于凝胶电泳的方法研究中，我们采用了一种特殊设计的梯度 凝胶电泳(GGE)系统，包括一个琼脂糖上样层，若干个不同浓度的 聚丙烯酰胺凝胶分级分离层和一个高浓度(40％)的聚丙烯酰胺凝胶 封闭层。采用富集的大鼠肝脏膜蛋白作为样品的实验结果表明，通过 电泳驱动的方式，GGE系统能够去除样品和凝胶中85％以上的SDS。 此外，通过这种电泳驱动的方式不仅能够对含有高浓度SDS的蛋白 质样品进行