运用GMP法超低温冷冻猪卵母细胞.pdfVIP

第十二届全国动物繁殖学术讨论会论文集 运用GMP法超低温冷冻猪卵母细胞 朱茛成1-一．张德福2 (1．上海农业科学院畜牧兽医研究所，上海，201106 2南京农业大学动物医学院，江苏南京，210095) 摘要：利用一种新改进超低温冷冻方法一GMP(glass 母细胞．结果29枚GV期卵母细胞冷冻后经IVM后有3枚完全扩散，打散颗粒层后1枚出现pbl，经 01)高于对照组；31枚MII期卵母细胞冷冻后FDA染上率为 FDA染色后100％R荧光，极显著(pO 71．0％．极显著(pO．01)高于对照组，证明是一种较为有潜力的冷冻方法。 关键词：超低温冷冻；GMP法；猪；卵母细胞 动物卵母细胞是遗传信息的载体之一．在遗 以备用。 传修饰和长期冷冻保存方面具有独特的优势。 1．2卵母细胞的采集 但猪卵母细胞不同于其他哺乳动物卵母细胞。其 卵巢取自上海市闵行区某屠宰场。将卵巢 内含有大量的脂肪颗粒，对低温很敏感，造成冷 放如含有双抗(青霉素500iu／ml，链霉素500iu／ 冻困难…I。当前，虽然研究猪胚胎或卵母细胞冷 m1)的37℃生理盐水的保温瓶内，1h内带回实验 冻方法有多种。但除最近取得较大进展之外，大 室．用灭菌生理盐水冲洗3～4次。然后置于干 多数方法的冷冻效率低，尚处在实验阶段。一般 净的塑料圆筒内．放入37℃的水浴锅中用于采 认为，猪卵母细胞比其胚胎对低温更敏感。冷冻 卵。用带有189针头的注射器抽吸直径为2～ 更困难…。本试验改进了一种新的冷冻方法一 6mm的卵泡，将吸取的卵泡缓慢地注入到50rrd 的塑料离心管中。静置10rain后，在实体显微镜 micropipette)法，对猪的GV期 ～一GMP(glass 和MII期卵母细胞超低温冷冻进行了研究，以 下选取具有2层以上颗粒细胞、形态正常和胞质 探讨运用本法超低温冷冻猪卵母细胞的可行性。 均匀的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，用 1．材料与方法 TCMl99洗3次，以备下步试验所用(在室温 1．1材料 25℃进行)。 除常规试剂和材料之外，另准备： 1．3超低温冷冻 1．3．1GV期卵母细胞超低温冷冻保存 TCMl99成熟培养液：按陈晓字等Cz]方法配 制。(TCMl99购自gibeo公司) 取约一半COCs(GV期)不经培养直接冷 冻。用移胚管将COCs转移到事先置于3TC恒 玻璃化冷冻液：采用EFS40，按朱士恩等[3] 方法配制。 温台上的EFS40中，平衡7rnin。分别用GMP GMP管：实验开始前，用外径约0．4cm的 管约10--13枚，EFS40液体积不超过30／A；麦管 玻璃管在酒精灯上拉细成直径约为200300p1， 第-l-二届全国动物繁殖学术讨论会论文集 两端还吸入05M蔗糖(即：蔗糖+空气+ 方法同未冷冻的卵母细胞的成熟培养。经 EFS40+空气+蔗糖)。装管之后将GMP管和 44h后，用0．1％透明质酸酶打散，洗涤3-4次． 麦管在液氮蒸汽中平衡3min，然后直接投入一 用于形态观察和成活鉴定。 197℃液氮。 1．6形态学检测 1．32卵母细胞成熟培养和冷冻 打散GV期和MII期卵母细胞颗粒层后，在 取一部分