重要濒危畜禽体细胞库生物学检测技术平台的建立.pdfVIP

畜牧部分 187 参考文献 —1288 215 [4]Fr蜘，R．I．ed．CultureManimal cells：AmanualMbasictechnique[M]，4th ed．AnimalCell Methodsand [5]N耐JenkinsBiotechnology Protocols[M]．New 重要濒危畜禽体细胞库生物学检测技术平台的建立。 娜日苏” 关伟军马月辉“ (中国农业科学院畜牧研究所北京100094) 摘要：按照美国ATCC体外培养细胞质量的检测标准对所构建的蒙古羊、五指山小型猪、德保矮马、北京油鸡、白耳 鸡、藏鸡、清远麻鸡和北京鸭等47个重要、濒危育禽遗传资源的体外培养细胞进行了细胞形态学、细胞活率、钿胞生长曲 线、微生物、核型、同工酶和外源基因在培养细胞中的表达等评定细胞质量的生物学检测与分析，搭建了重要、濒危言禽品 种体细胞库生物学特性研究的技术平台。 关键词：成纤维细胞系；细胞培养；生物学特性；技术平台。 近些年来，由于生态环境的不断恶化、国外畜禽品种的大量引进和集约化养殖等诸多因素的影响，导 致我围很多优良地方畜禽品种的灭绝或处于濒临灭绝状态，这已引起我国政府的高度重视。因此，从我 国畜禽种质资源保存的实际出发，运用现代生命科学领域，特别是细胞生物学、分子生物学和细胞工程等 学科所涌现出的新理论、新方法和新技术构建重要、濒危畜禽品种群体细胞库的方式来保存其基因资源 具有重要意义。 1材料与方法 1．1实验材料 蒙古羊、五指山小型猪、德保矮马、北京油鸡、白耳鸡、藏鸡、清远麻鸡和北京鸭等47个品种的体外培 养细胞。 1．2实验方法 1．2．1细胞形态学观察 在相差显微镜下，对细胞生长状态、培养液颜色变化以及细胞是否发生污染等进行观察。 ·项目资助：基础性工作重大专项(2001DEAl0006)，国家自然科技资源平台建设项目(2004DKA30450)。 料作者简介：娜日苏(19S0一)，女，内蒙古人，蒙古旗，硕士生，研究方向为动物遗传育种。 net 188 2006学术年会 1．2．2微生物检测 均参照文献[13方法进行。 1．2．3细胞生长曲线绘制 用常规方法消化细胞，计数，接种，连续定时计数，绘图，即得培养细胞的生长曲线。 1．2．4细胞活率测定 采用台盼蓝拒染试验法，分别对冻存前和复苏后的细胞进行活率检测，以活细胞占细胞总数的百分 比计算细胞活率。 1．2．5核型的制备 ． 按照常规方法进行染色体制片01，gimesa染色后油镜下观察并照相。对50个铺展完好的中期相统计 染色体数目，计数50—100个分裂相好的染色体数目，并依照文献报道方法制备核型oJ。 1．2．6同工酶分析 用常规法收集细胞，记数，清洗，提取蛋白质，一70。C贮存备用。采用不连续梯度聚丙烯酰胺凝胶电 泳法对蛋白质样进行电泳，染色，拍照“J。 1．2．7外源基因在培养细胞中的表达 (1)荧光蛋白报告质粒的制备及鉴定：对已转化了荧光蛋白质粒的大肠杆菌采用碱裂解法进行提取、 纯化后经紫外分光光度汁测定质粒浓度，再用BamHI酶切。采用1％琼脂糖电泳鉴定酶切结果，确立该 质粒为实验所需的质粒。 (2)脂质体介导法转染成纤维细胞：转染前1天，消化接种12孔板。转染前，挑取生长旺盛、形态好的 细胞用无血清培养液漂洗，将DNA、脂质体和无血清培养液的混合物滴加在细胞表面，培养6～10h。换含 血清的培养液，继续培养细胞。在激光共聚焦显微镜下记录转染情况。 2结果与分析 2．1细胞形态学观察 大量的试验结果表明：当细胞生长状态良好时，其形态为典型的成纤维状，呈现梭形或不规则三角 形。对细胞群体的全貌观察，所培养的细胞均呈放射状、火焰状或漩涡状走势，且细胞生长健康旺盛。 2．2微生物检测结果分析 2．2．1真菌、细菌检测 检测结果显示：分别接种有动物细胞的大豆胰蛋白胨培养基和