高效液相色谱—磷钼兰比色法在研究植物质膜磷脂中的应用.pdfVIP

高效液相色谱一磷钼兰比色法 在研究植物质膜磷脂中的应用 徐淄郑志侠2潘同应7赵玲‘ ＆徽省地质实验研究所合肥230001，2中国科学技术人学化学系合肥230026) 摘要：将制备的细胞质膜样品用高效液相色谱分离，测定其紫外吸收光谱， 再用磷钼兰比色法测定磷的分布，然后进行磷脂的定性分析。借助于该法 可获得纯化的磷脂，并用于磷脂的进一步研究。 关键词：磷脂、植物质膜、高效液相色谱、比色＼ 文献标识码： 中图分类号：0652．63；0657．32 质膜是包裹各种细胞器而使细胞内部与环境分隔的生物膜，它的基本 成分是蛋白质、磷脂、糖脂、胆固醇，而质膜上磷脂的数量是最多的。磷 脂的多分子层构成了生物膜的基本骨架，主要起通透屏障作用，因此在生 命科学研究中与磷脂有关的元素形态分析和生物可给性研究受到人们的关 注‘“到，建立在磷脂定性分析的基础上，获取纯化的磷脂是该项研究中的一 项基础工作，本文提出用高效液相色谱分离质膜样品，测定其紫夕[-(2lOmm 处)吸收光谱，再用磷钼兰比色法测定磷的分布，从而进行磷脂的定性分析， 借此可获得纯化的磷脂。 一、 实验部分 1．1 仪器与主要试剂 光度计(日本日立公司制造)。 试剂 }6 为超纯，其余试剂为分析纯。所用水溶液均用新制得的石英亚沸蒸馏水配 制。 1．2细胞质膜的制备 应用William J2-21m 的Tris—Mcs和0．25M蔗糖)。匀浆液在Beckman 55．72 清液再于13，0009离心，得到的上清液在HITACHI 离心30min，将得到的沉积物悬浮在20ml缓冲液中(其组分为lmM pH=7．0 含有1mMpH为7．2的EDTA和ImMDTT)。 00mMTris． 4000rpm下离心30min弃去不溶物，将此质膜组分的上清液收集。 1．3富磷脂粗品的制备 r7 用有机程序‘51将上述制得的质膜组分的上清液进行富磷脂粗品的提取 主要程序见图l 清液(弃去) 在真空干燥器 质膜提取液 溶液 !堕奎圣壁，富磷脂粗品 沉淀 残渣(弃玄) 图1 1．4高压液相分离紫外检测 磷脂从细胞内提取出来后，虽已除去了大量与制备理化性能差别较大 的杂质，仍剩余与制备理化性质相近或类似的物质必须进一步纯化。 高压液相色谱的分析速度快，分离效果好。鉴于磷脂在210hm处有很 强的吸收【6】。所以用其紫外检测灵敏度高，对样品无破坏性，且操作方便。 对目前应用最多的两种流动相体系乙腈一甲醇一水和正己烷一异丙醇一 水，我们选用后面的体系，因为它几乎能将所有的磷脂分开。 本文采用流动相的梯度洗脱程序【71为。一lomin含水4％的正己烷一异 溶液，在此条件下保持至高无上30rain。 (15cmxO．46cm)；积分液体积为5mL；流速为1mL／min。 1．5比色法测定磷的分布 虽然磷脂在210nm附近有很强的吸收，但这种吸收并不是磷脂特有的， 因此需要用检测磷来做进一步的确定。 中。 取下泠却，移入10ml比色管中，定容5ml刻度，摇匀。 lO；20，加入少量水，以下手续同样品分析。将显色完全的标准与样品用 lcm比色杯，于660nm处测量吸光度。