重组卡介苗表达的MalE蛋白T细胞表位的鉴定.pdfVIP

空鱼董堕璺堕芏量查堑里壁垒蔓±壅堂主堕过皇堡皇塞 重组卡介苗表达的MalE蛋白T细胞表位的鉴定 焦新安 刘秀梵 (扬州大学农业部畜禽传染病学重点实验室．扬州) RichardLo一manEdithD邑riaud Sophie BurgaudBrigitteGicquel NathalieWinterClaude Leclerc (法国巴斯德研究所免疫调节生物学实验室．巴黎) 摘要 为鉴定重组卡介苗表达的MalE蛋白T细胞表位及其多样性．采用抗原提呈试验、T细胞增殖试验、 四种H一2d限制性T细咆表位。在四种表位中，邮8～82是重组MaIE蛋白的主要T细胞表位，而其余三个为次要 表位． 关■词重组卡介苗MalE蛋白T细胞表位 的疫苗已成功地分别表达二十余种病毒、细菌和寄生虫的抗原，亦已证实，这些rB(好可诱导产生 和运送外源抗原载体的可行性得到确认，但迄今BcG或rBcG与宿主免疫系统相互作用机制还知 之甚少。为了开展此项研究，需要建立一个良好的研究模型，以利于测定它们与免疫细胞相互作用 的效应，从而探寻其中的一些规律。现已知大肠杆菌MalE蛋白是经MHc I类途径提呈的模型蛋 白．它具有H一2d限制的4个T细胞表位，且针对它们的cD。+T细胞杂交瘤亦已建立，为本研究 奠定了重要基础。在获得表达MalE的rB(’G后，通过体内、体外试验证实BcG功能性表达了 MalE蛋白及其主要T抗原表位，这为进一步开展免疫生物学基础研究提供了必要的物质基础。 l材料和方法 1．1 Genestint．Isle， 小鼠 6～lo周龄雌性BALB／c(H一2d)近交系小鼠，购自Janvier公司(Le France)。 1．2 细胞系 在抗原提呈试验中使用的细胞系是固定化的未成熟树突细胞(Dc)系D2scl(H一 L3多肽和MalE蛋白质以标准PEPScAN程序‘”将多肽合成于聚乙烯针上，依据MalEaa序 列”3，共合成385个相互重叠的15肽库，合成以mg级进行，策略是每种15肽合成结束，向后推移 一个aa，再合成下一种15肽。此外，采用王氏树脂(对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂，BAcHEM， switzerland)按标准程序合成MalE序列中68～82aa，100～114aa，151～l65aa和277～291aa等区 赠(巴斯德研究所，巴黎)。 于添加o．1％Tween 80和ADc的Middlebrook 一247— 主旦童墼璺匡兰童塞塑芏堂垒蔓±壅兰茎叠过童堡塞整 oADc的Middlebr。ok 型表达于大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pIH71。在pIH71中，含有信号肽序列的MalE基因被插入 ein 卡那霉素的LoewenstJensen培养基，然后再转至sauton培养基培养，收获后，计数cFu，于一 70c保存，备用。 1．s rBcG·MalE或BcG·wt 酶联免疫斑点试验(ELIsPoT)每只BALB／c小鼠静脉注射106 1 RPMI640(GibcoBRL， 或PBs；免疫2周后，无菌手术取出免疫脾脏，每只脾脏置于一盛有5ml I，ife LTD)完全培养基(简称cM：RPMI TechnoIogies L一谷氨酰胺和5×lo。5M2一琉基乙醇)的平皿中，用毛化载玻片充