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重组酵母发酵过程的代谢流模型验证① 周海英’’，表景淇’，’，易静’ (I!几海交通人学自动化系 I海 200030;2华东理工大学国家生物反应器下程中心 r.海 200237 3 海第一医科大学细胞生物系 P.海200025) 摘 要:分析f毕氏醉母以}I油和甲醇为碳源的代谢途径，建Ii:I利用毕氏醉毋(Pichiapasforis)生产或组蛋 自发醉过程的动力学模型。用四批实验数据对模型进行了验证。结果表明，该模型能较准确地描述细胞生长和 重组蛋白合成过程。为进一步的毕氏醉母发醉过程操作优化打好了荃础. 关健词:毕氏醉毋，重组自蛋白，代谢流模型 1引言 甲醇营养型毕氏酵母Pichiapastaris在最近 10年得到了学术界和}_业界的充分重视，属迄 今发现的最优良的异源蛋白表达系统之一。截至 1999年，已有200余种重组蛋白在毕氏酵母中得 到了成功表达”‘。己经面市的重组蛋白包括人胰岛素、乙肝疫苗等。毕氏酵母表达系统的突出优势 在于:目的基因表达稳定、目的产物的胞外分泌、杂蛋白含量低、易于高密度培养、生产成本低以 及易于后续修饰，等等，’”。该重组菌的最高表达量己达lIg/Llo然而，毕氏酵母的发酵动力学模 型研究迄今少有报道。过程优化控制则基本上属于空白。本文以人重组白蛋白的发酵生产为例，分 析了毕氏酵母分别以甘油和甲醇为碳源时的代谢途径。在此基础上，建立了胞内外物质流和胞内能 量流的平衡方程，获得了该菌株在两种基质 卜的代谢流模刑。这一模I，能够提供比碳源消耗速率、 比氧消耗速率、比乙酞辅酶A生成速率、细胞比生长速率等关键反应速率的仿真值。它与反应器模 型相结合即构成了完整的系统模型。实验验证结果表明，该模型系统有足够高的精度。这为进一步 的细胞循环控制和最优比生长速率控制奠定了基础。 2过程建模 2.1过程简介 作为一类最简单的真核细胞，迄今人们对面包酵母 (S.cerevisiae)的研究比较成熟。面包酵母 与毕氏酵母同属于芽殖真核细胞，并且细胞的体积及形态类似，故有关面包酵母的研究结果对毕氏 酵母建模有一定的借鉴作用。Pertev.C141根据代谢速率瓶颈的假设建立了酿酒酵母的动力学模型，指 出菌体在供氧能力的不足时，会生成乙醇，而在没有呼吸瓶颈限制时发酵罐内的乙醇也可被利用。 文献[[51提出了面包酵母细胞代谢过程中的限制性步骤:(1)碳源的传递速率限制;(2)呼吸容限限制; (3)丙酮酸脱狡生成乙酞辅酶A的最大速率限制。在以F的讨论中将可看到，这些结论对毕氏酵母基 本使用。以毕氏酵母为宿士菌的重组人血清自蛋白 (rHSA)表达系统利用甲醇可诱导的醇氧化酶 (AOXI)启动子。攘个发酵过程分两段，第一阶段为甘汕生长期，以高密度菌体培养为日标。第 二阶段以甲醇作为诱导剂、碳源和能源以获得期望的产物。格个发酵过程流加氮水((17%)以调1jpH, 辅以$m度和溶解氧定值控制。 2.2代谢流模型 在以甘油为基质的菌体生长期间，胞外甘汕在甘油激醉的催化 卜磷酸化进入胞内，形成3-磷酸 甘汕。记其传递速率为9s,用S.(与培养基中的甘油浓度S相同)和S,(分别表示胞外和胞内的甘 汕浓度，则有: Iq水自然科M -All盗助 1如 S，一I)S,. (1) 胞内甘油一部分同化为细胞组成物质.一部分通过糖醉解途径16.71先在3一磷酸甘油脱氢酶的催化 卜氧 化成磷酸=羚丙酮，然后分解为丙酮酸、ATP和NADHZ。简化的代谢流见式 (2).(3)0 2 ( S;,- Pyruvate+ATP+2NADHZ S一K生Cellmaterial 3 ( 视氧的限制及丙酮酸脱梭反应的瓶颈情况，丙酮酸进入两条代谢途稗,在供冬不足以及碳源过剩受到 丙酮酸脱梭反应的瓶颈限制时，转化为乙醛，见