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86-第十章 蛋白质的测定 第十章 蛋白质的测定 第一节 食品中pro的含量 * 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大。由C、H、O、N、S五种元素组成。蛋白质溶液是典型的胶体分散系，是具有光学活性的两性物质。 * 食品中蛋白质的含量分布是不平衡的。一般植物组织的含量低于动物组织。植物中pro含量很少，一般为0.5-3%（鲜重），在果实中一般为 0.4-1.5%（鲜重），黄豆中pro可达40%。由动物中肌肉及内脏中pro含量校多。牛肉20.1%,乳粉26.2% * 蛋白质的定量是基于测定总有机氮。但某些物质又含有大量的非蛋白氮化合物（如马铃薯等），必须把pro提出来，分别测总氮及非蛋白氮就得到纯蛋白氮。Pro的量一般是按照总氮量乘上一个合适的蛋白质换算系数来求得的。这个系数决定于物质中pro的含氮量。Pro的含氮量一般为15-17.6% 。如为16%则换算系数为=6.25（鸡蛋、青豆、肉、玉米等） 第二节 pro定量法 * 物理方法：折射率、比重、紫外吸收等方法，操作简便。 * 化学方法：凯氏定氮法、杜马法、双缩脲法、福林(Folin)--酚试剂法、染料结合法。 * 这些方法中定氮法、双缩脲法，物理法，是利用pro共性（如含氮量、肽键、折射率等）的方法。其它方法是利用pro的特定氨基酸残基（芳香基、酸性基团、碱性基团等）的方法。 最基本和最常用的方法是测定总氮量，再由总氮量计算蛋白质含量。凯氏定氮法和杜马法。 * 凯氏定氮法：最准确和操作最简单的方法之一同时测定多个样品是法定的标准检方法。 * 杜马法：多半用于有机分析，很少用于食品分析 * 双缩脲反应法：在碱性环境中，双缩脲与CuSO4结合生成红紫色的络合物，此法称为双缩脲反应法。双缩脲法和酚试剂法是生物领域进行科学研究经常使用的方法。 * 染料结合法：正在急速发展的新方法。 * 一、半微量凯氏定氮法（微量、常量凯氏定氮法） * 1、原理：蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化使蛋白质分解。分解的氨与硫酸生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨分离。用硼酸吸收后，再用标准硫酸或盐酸滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数。即为蛋白质含量。 * 2、过程：消化--蒸馏--吸收与滴定 * （1）消化：样品中含氮有机化合物经浓H2SO4加热消化，SO2使N还原为NH3气，NH3与硫酸结合成（NH3）2SO4。硫酸使有机物脱水，有机物炭化生成碳，C将H2SO4还原为SO2，C变为CO2。SO2使N还原为NH3，SO2氧化为SO3， NH3+H2SO4----（NH4）2SO4 * （2）蒸馏：（NH3）2SO4在碱性条件下，释放出氨。 * （3）吸收与滴定：蒸馏时放出的氨，可用一定量的标准硫酸溶液吸收，用标准NaOH反滴定过量的H2SO4，（或用硼酸溶液吸收，再用标准HCL或H2SO4溶液直接滴定。）则计算出总氮量，推算pro含量。 * 反应如下：2CH3CHNH2COOH+13H2SO4-- * （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O （ pro为氨基丙酸） * （NH4）2SO4+2NaOH--２NH3+2H2O+Na2SO4 * NH4HB4O7+HCL+5H2O--NH4CL+4H3BO3 * 3、样品的分解条件： * 在消化过程中，为了加速分解过程，常加入下列物质： * （1）K2SO4或Na2SO4 作用：是提高溶液的沸点，加速对有机物的分解作用。 Na2SO4不及K2SO4效果好。 * （2）催化剂：而且Hgo.Hg是剧毒物质。注意通风污染环境价格贵。 * a.CuSO4作催化剂呈蓝色，还可作下一步蒸馏时作碱性反应的指示剂。 * b.氧化汞和汞：HgO是效能较高的催化剂，可得氮的最佳回收率。注意：容易生成硫化汞沉淀可使反应液引起暴沸，防止暴沸的措施是添加锌粒。而且Hgo.Hg是剧毒物质。注意通风污染环境价格贵。 * c.硒粉：催化效能较强，可大大缩短消化 时间，但用量不宜过多，消化时间不可过久，并小心控制温度，否则将引起氮素损失。 * (3)氧化剂：添加氧化剂是帮助有机物消化，但要防止NH3进一步氧化为N。 * a.次氯酸钾和高锰酸钾：强氧化剂会使氨氧化为氮而损失，一般不易使用，但含C高时，可用KmnO4 。 * b.过氧化氢：消化速度高，操作简便，须冷却后加入过氧化氢。 * 4、具体操作步骤： * （1）、消化： * 精密称取固体样品0.2-2g,半固态2-5g液体样品10-20ml 于凯氏烧瓶（30-50ml）加入无水K2SO42g,CuSO40.2 H2SO4 20ml 。 凯氏烧瓶成45倾斜先小火加热待泡沫停止后加大火（330-400），直到溶液