基因工程的应用与进展.ppt

基因工程的进展与应用; 基因工程的内容;第一部分 基因工程基本技术-复习;第一部分 基因工程基本技术-复习; 根据不同的目的选择不同的策略和技术路线;Ⅱ 基因工程的基本过程及研究策略;基因工程过程示意图;第一部分 基因工程基本技术-复习;二、 基因工程的基本过程及研究策略; 目的基因的制备;RT-PCR;二、 基因工程的基本过程及研究策略;;;表达载体;表达载体;二、 基因工程的基本过程及研究策略; ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ;二、 基因工程的基本过程及研究策略; 转化（transformation）：把以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。 转染（transfection）：以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程。 转化子：又称工程菌，即接受了重组DNA的受体菌。;转化方法 氯化钙转化法 脂质体转化法 电转化法;二、基因工程的基本过程及研究策略;平板筛选 酶切、电泳筛选 PCR筛选 核酸杂交 DNA测序 免疫学检测法 Western blot;二、 基因工程的基本过程及研究策略; ;第一部分 基因工程基本技术-复习; ;;几种常见的原核 细胞表达载体; ; 真核表达载体;毕赤酵母表达载体pGAPZα物理图谱 —非分泌表达 ; 真核表达体系; ;2. 病毒型载体 外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重组DNA随病毒颗粒而复制 (多需辅助病毒或包装细胞的存在)。如：逆转录病毒载体、腺病毒载体等 ;病毒型载体的类型; 基因工程的内容;（一）噬菌体展示技术的建立和原理 （二） 常用的噬菌体展示技术 （三）噬菌体展示技术在生命科学中的应用;;（一）噬菌体展示技术的建立和原理;噬菌体展示技术的基本原理;;700bp;（二） 常用的噬菌体展示技术;根据用途分类 噬菌体随机肽库技术 噬菌体抗体库技术 噬菌体cDNA文库技术 ;1.噬菌体随机肽库技术;常用的随机肽库;(2)用靶分子筛选 基于抗体与抗原、受体与配体、酶和底物结合的特异性，将靶分子包被在96孔板上，从随机肽库中快速筛选到能结合靶分子的多肽。;;3.用途：为药物开发的强有力工具 抗原表位的筛选 蛋白相互作用筛选 酶的底物和拮抗剂的筛选 受体的激活剂和拮抗剂的筛选 ;2. 噬菌体抗体库技术 （antibody phage display);ScFv型抗体 Fab型抗体 ;; 噬菌体抗体库的类型 　1．天然抗体库： 抗体基因来自非 免疫个体B细胞的mRNA，针对各种 抗原，和低 2．免疫抗体库： 抗体基因来自免 疫个体B细胞的mRNA，针对特异 性抗原，亲和力强;3.噬菌体cDNA文库;cDNA噬菌体库 的建立 逆转录合成cDNA 连接EcoR I适配子 Xho I 酶切 与噬菌体载体重组 体外包装 cDNA表达文库 ;;（三）噬菌体展示技术在生命科学中的应用;1.噬菌体抗体库技术在人源性抗体制备中的应用 在医学微生物研究领域: 抗HSV、抗HCV、抗汉坦病毒、抗狂犬病毒 在寄生虫病研究领域 : 抗日本血吸虫 肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病研究领域;利用噬菌体抗体库技术制备人源性TAT-Fab抗体;精制破伤风抗毒素（TAT）： 马血清免疫球蛋白制品，过 敏反应 人破伤风免疫球蛋白（TIG）： 血源来源困难，病原微生物 的污染 噬菌体抗体库技术 人源性、无污染;主要工作;;人Ig轻链基因库构建和鉴定; 人Fab抗体基因库构建及鉴定;人Fab抗体在噬菌体上的展示;展示人源TAT-Fab抗体噬菌体的筛 选和富集;;人Ig轻链基因库构建和鉴定;人Fab抗体基因库构建及鉴定;人Fab抗体在噬菌体上的展示;展示人源TAT-Fab抗体噬菌体的筛选和富集 ; 产率=筛选后的噬菌体滴度/筛选前的噬菌体滴度×100% ;可溶性人源TAT-Fab抗体在大肠杆菌的表达及鉴定 ;可溶性人源TAT-Fab抗体鉴定 SDSWestern blot;2.随机肽库技术在生物  医学和药物研制中的应用;(1) CD137配体肽的筛选;;随机肽库;从7肽随机肽库中筛选CD137肽配体：对23个克隆进行了测序 ;xHxHxxxHxxxx sequence （70%） DHW