噬菌体phi29 pRNA载体在RNA干扰中的初步应用研究.pdfVIP

第23卷第2期 病 毒 学 报 V01．23NO．2 2 0 0 7年3月 CHINESEJOURNALOFVIROLOGY March2007 噬菌体phi29pRNA载体在RNA干扰中的初步应用研究 田拥军1、2，张正茂1，杨燕2，覃莉1，孟忠吉1，刘慎沛2，杨东亮1 (1．华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室，湖北武汉430030； 2．华中科技大学同济医学院附属同济医院实验医学研究中心，湖北 武汉430030) 关键词：噬菌体；pRNA；RNA干扰；乙型；肝炎病毒 中图分类号：R373．2文献标识码：A 文章编号：1000—8721(2007)02—0148—05 1 RNA干扰是在细胞胞质中双链RNA(dsR—pRNA对培养细胞无毒性作用 NA)介导的序列特异性mRNA的降解[1]。这个过 8种pRNA由美国普度大学郭培宣教授提供， 程是由21～25个被称为小干扰RNA(siRNA)形成 Ab7 分别为：pRNA／23／97 的dsRNA完成[2]。目前，这一技术已经广泛应用RNA、pRNA／SRT-survivin 于研究基因的功能，病毒感染治疗等方面。但是， EGFP—siRNA Ab’、pRNA／HBV siRNA在体内容易降解，干扰作用持续的时间不／Survivinribozyme、pRNA／HBV 长。新的研究表明枯草杆菌噬菌体phi29有一种稳／18S 定的具有载体特性的RNA分子。该RNA由120 个碱基组成，具有将噬菌体DNA包装入衣壳中的 5’末端的磷酸基团可以诱导细胞产生干扰素应答， 作用，被称为包装RNA(PackagingRNA，pR- 导致细胞程序性死亡。本实验中的pRNA经过小 NA)E3]。研究表明，phi29pRNA在体外可以形成牛碱性磷酸酶处理，去除了5’末端的磷酸基团。为 性质稳定、不易降解的二聚体、三聚体、四聚体和六 证实pRNA对细胞是否有毒性，在24孔板中接种 聚体_]，同时还可以作为载体在其3／5’端连接外源 RNA分子，作为载体携带小分子RNA[5]，不影响正 常结构和折叠。pRNA携带的siRNA在细胞内被 Dicer酶切割后释放出siRNA，发挥对目的基因的 1．5ml LipofectamineTM2000(美国 Ep管中1．0t,l Bvi- 特异干扰作用[5]。乙型肝炎病毒(Hepatitis rus，HBV)引起的乙型肝炎是对人类健康危害严重 的传染病。HBV感染后可以引起慢性肝炎、肝硬化 并增加肝癌发生率[6]。目前，临床使用干扰素、核苷 分别加入到各孔，36h后观察细胞生长情况，同时将 类似物治疗HBV感染，可以抑制HBV的复制，但 细胞消化后收集，用台盼蓝染色，记数活细胞所占的 患者对干扰素的反应性、核苷类似物治疗引起的耐 百分数。该实验重复3次。结果显示，8种pRNA 药突变等，使HBV的治疗面临一定问题。RNA干 对细胞没有毒性作用，细胞形态与对照相比没有区 扰是一种新的治疗HBV感染的方法，该方法可以