哺乳动物细胞表达.ppt

与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。;研究现状 ? ?? ? ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。? ?? ? ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。? ?? ? ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/ l08细胞 /24小时。有人认为其限速步骤可能是在工程细胞中重组蛋白的分泌效率较低。 ;1 表达载体 ? ?? ? 1．1 表达栽体的类型? ?? ? 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。? ?? ? 根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。;病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视。;质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在。而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点 的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。;为了将含目的基因的载体导入哺乳动物功物细胞．还必须加入遗传选择标记。常用的标记基因有胸腺激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因等.dhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加。当培养基中逐新增加氨甲蝶呤(MTX)的浓度时，随着细胞对MTX抗体的增加。dhfr基因与外源基因均明显扩增。据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。;? 1．2 表达载体的结构元件 ? ?? ? 哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。可视实验需要加入标志基因、复制起始点序列、内部核糖体进入位点等。基于启动子／增强子是表达载体中最重要的元件，我们这里仅对它做简要介绍。? ?? ? ?? ;?目前常用的强启动子包括人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)、人延伸因子1-亚基启动子和Rous肉瘤长末端重复序列；Invitrogen公司开发的pcDNA、pEF和pRL三种系列载体即分别是以这三种启动子驱动目的基因的表达。常用的增强子有Rous肉癯病毒基因长末端重复序列和人巨细胞病毒增强子。构建杂合的启动子是获得新启动子的一个重要途径。;2??宿主细胞 ? ?? ? 哺乳动物细胞表达外源蛋白最初是将抗体基因重新导人淋巴细胞中由病毒(如SV40)或lgG的启动子增强子引导。产生的抗体具有相应的结合能力和数应功能，但表达量很低。? ?? ? 常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等。不同宿主细胞表达的重组蛋白其稳定性和蛋白糖基化类型不同，需根据要表达的目的蛋白选择最佳的宿主细胞。; COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突变。;CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比，是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。已用于多种复杂的重组