实验3-质粒DNA的提取.pptVIP

实验二：质粒DNA的提取;一、实验目的与背景;;载体类型 ;① 复制子 ② 有一个或多个利于检测的遗传表型 ③ 有一到几个限制性内切酶的单一识别位点 ④ 适当的拷贝数;质粒能自主复制，在细菌中不断复制自身。在细胞内的复制分成两种类型：一种是低拷贝数的质粒，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，这种类型称为“严谨型”复制的质粒；另一种是高拷贝数的质粒，拷贝数一般在20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒 质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（如抗氨苄青霉素、抗四环素等），耐受重金属，产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了这些额外的特性;;;;二、实验原理;碱裂解法提取原理 （78页）;;三、仪器、材料与试剂;;四、实验步骤;8. 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1），反复混匀，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中 9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀???，室温放置30min 10. 12000r/min离心5min，倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 11. 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡，12000r/min离心5min，倒去上清液，空气干燥 12. 加20μL纯水或TE（含20μg/mL胰RNA酶），使质粒DNA完全溶解，－20℃保存 13 在下次实验中观察实验结果，通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA;　碱裂解法流程图; 超净工作台：每班2台（酒精灯、移液枪一套、火柴、废液缸、酒精棉球） 接种8人1组，培养25 mL菌液（100mL锥形瓶）。每班大约接种3瓶。 质粒提取操作1人1组，每人吸取1.5mL菌液。 移液枪4人1套，共3支（1000μL/200μL或100μL/20μL），配套枪头3盒（篮、黄、白）。;五、思考题;溶液Ⅰ:悬浮细胞,抑制DNase;溶液Ⅱ：裂解细菌，变性DNA和少量蛋白质;溶液Ⅲ：使大部分蛋白质和细菌基因组DNA沉淀;酚/氯仿/异戊醇：抽提去除蛋白;无水乙醇：沉淀质粒DNA;菌体老化 碱裂解不充分 菌体中无质粒 溶液使用不当;混有蛋白 混有RNA 混有基因组DNA ;