第五章基因克隆载体.ppt

原核生物基因表达载体 pKK223-3 2 ） 原核生物基因融合表达载体 一般特性： a）含有高水平表达的启动子 b）基因的表达可被诱导（化学物、温度等） c）在原核宿主中表达，产物为融合蛋白 d）表达产物易于分离纯化 GST基因融合表达载体（pGEX-5X-3） 谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST） 蛋白A基因融合表达载体(pEZZ18) 特点: a) 含有蛋白A信息序列和两个合成Z区． b) 表达产物为分泌蛋白，Z区可与IgG－ Sepharose 6FF结合，易于纯化表达产物． pEZZ18载体 pMC1871融合表达载体 特点：含有?-半乳糖苷酶，外源基因插入E.coli lac Z基因中，表达杂合蛋白，而杂合蛋白的?-半乳糖苷酶活性可作为检测标记． pMC1871载体 2.哺乳动物基因表达载体（pKSV-10） 特点：a）穿梭质粒载体（可在E.coli 中复制保存）． b）含有质粒复制的起始位点和抗性标记（Apr）． 3.植物基因表达载体（pCaMVCN） 特点：a） 含有CaMV35S启动子和Tn9的Cat基因． b）在单子叶植物和双子叶植物中均有活性 ． 杆状病毒表达系统(baculovirus expression system) 目前被广泛应用的是苜蓿银纹夜蛾多核型多角病毒(AcMNPV),属一种溶原性病毒。基因组为双链DNA，可感染节肢动物。 国内应用的是家蚕核多角病毒。 特殊用途克隆载体 启动子探针型克隆载体 诱导型表达克隆载体 反义表达克隆载体 组织特异性表达克隆载体 含增强子表达载体 。。。。。。 作业题：1. 根据已有的质粒载体构建基因克隆载体，要求新构建的克隆载体能在含氨苄青霉素（Apr）和卡那霉素(Kar)的培养基中生长，有可插入外源DNA片段的多克隆位点(MCS)，且分子量小于2.5 kb．(E: EcoR I； B：BamH I；K：Kpn I)。 2. 如何将野生型细菌质粒改造为基因克隆载体？ 3. YAC载体具有那些特性？ * int 整合；xis 删除 * 溶菌 溶原 * * 5489-6005（507bp）是基因间隔区（IS区） * IS区Bsu1位点，插入LacZ的HindIII片段 * 包装严格。 * * 1)SV40 DNA的一般特性 SV40 DNA为环状双链DNA（5243bp），与宿主细胞组蛋白H4，H2A，H2B和H3结合，组成念珠状核小体-微型染色体（mini-chromosome） SV40 DNA编码两个基因区，早期转录区和晚期转录区，分别以相反的方向转录 SV40基因转录图 SV40 DNA单识别位点限制性内切酶位点 限制性内切酶 识别位点 Kpn I 294 Nae I 343 Hpa II 346 Hae II 832 EcoR I 1782 BamH I 2533 BstX I 2759 Taq I 4739 Bgl I 5235 2） SV40-DNA的转录、复制与增殖 SV40 感染并进入细胞 病毒DNA进入细胞核 进行早期转录，合成T抗原 启动病毒DNA复制 晚期转录，合成包装蛋白 组装成病毒颗粒，细胞裂解 3） SV40 DNA衍生的克隆载体的构建 构建SV40 DNA衍生克隆载体的策略 a) 保留完整的T-抗原基因. b) 保留复制起始点(Ori), 间隔区和终止序列 c) 替换晚期转录区基因或部分早期转录区. SV 40 DNA晚期转录区取代型载体 重组病毒质粒载体 含有完整早期区段和复制起始点的病毒质粒载体 2. 腺病毒克隆载体 腺病毒（adenovirus, Ad）是一类无囊膜的20面体病毒，含有一个线性双链DNA分子。