猪口蹄疫病毒多抗原表位重组腺病毒的构建与鉴定研究.pdfVIP

第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 但目前报道的人和动物消化道共生乳酸杆菌表达载体系统，多是以抗生素抗性作为外源基因稳定表达 的压力。然而由于抗药性基因不断向环境中漂移扩散。可能造成对环境微生态的破坏，带来严重后果，因 而这类表达系统离“可食性”的要求还有很大的距离，不能直接用于人和动物。所以构建以营养因子代替抗 生素基因作为载体表达的选择压力具有非常重要的意义。非抗生素抗性为选择压力的表达系统是以细菌的 管家基因缺陷菌株为受体菌，在质粒上克隆入同源或异源完整的受体菌缺陷基因，作为外源基因稳定表达 达系统发展很快。目前比较成熟的系统包括：胸苷酸合成酶基因(thymidylate 口一半乳糖苷酶基因、SSB基因、D．木糖异构酶基因、琥珀突变体、赭石突变体、乳链菌肽及其它的营养 生长因子基因等【8，91。 的载体pW425t非抗性表达载体和将柔嫩艾美耳球虫S07基因成功表达的基础上。应用反转录聚合酶链式 素抗性的的穿梭表达载体pW425t进行重组。 此载体是在大肠杆菌和乳酸菌之间穿梭表达的质粒，所以重组载体首先在大肠杆菌中表达，因为大肠 杆菌具有遗传背景清楚、培养方便、操作简便、尤其是应用氯化钙转化方法简单。重组载体转化入thyA 基因缺陷型的大肠杆菌感受态E．coli 先在大肠杆菌中表达及其是否具有反应原性，为下一步pW425t-Vp7在乳酸菌受体菌株中表达提供依据， 也为研制口服轮状病毒乳酸菌疫苗奠定基础。 参考文献略 猪口蹄疫病毒多抗原表位重组腺病毒的构建与鉴定 社以军，姜平¨，杨晓玮，汤景元，李玉峰，李永东 (南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京，210095) 因在mRNA水平上可有效表达；应用O型口蹄疫病毒标准阳性血清进行间接荧光抗体试验，在rAd．VP感 位氨基酸的基因进行了成功的表达，从而为FMDV多抗原表位腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。 关键词：口蹄疫病毒；重组腺病毒；表位 Disease El蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(Foot．and-MouthHrus，FMDV)引起的偶蹄动物的一种急 性、高度接触性传染病。口蹄疫在全世界的分布范围广危害性之大使得消灭和控制口蹄疫成为各国政府共 同关注的问题。灭活疫苗的免疫接种是控制该病的主要方法，但只能提供短期保护，对七种血清型具有型 特异性Il】，而且存在病毒灭活不完全和病毒逃逸的潜在危险，因而基因工程疫苗的研究成为FMD研究的 热点之一。 395 猪传染病 功能f4】，也是重要的B细胞抗原表位。所以，以上抗原表位是研究FMDV基因工程疫苗的首选抗原分子。 不同抗原表位组合的腺病毒活载体疫苗奠定基础。 1材料与方法 1．1细胞、血清、菌株和质粒 医研究所惠赠，腺病毒穿梭载体pShuttle．CMV、骨架载体pAdEasy。l、大肠杆菌BJ5183均购自Qbiogene 1．2试剂和酶 Transfection Plasmid纯化试剂盒购自QIAGEN公司，TransFast QIAGEN 购自Promega公司，Marker DNALadder DNA聚合酶、T4 Marker、KpnI、XhoI、Hindlll、rTaq 凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司，Pmel、PacI购自Biolab公司，ProteinA．FITC购臼武汉博士德生物工 程有限公司。 1．3引物设计和基因的合成 根据质粒pT-VPlC．2B 点，3’端终止密码子TAA后为翩ndⅡI酶切位点。 1．4串联基因的克隆与测序分析 pShuule．CMV-VPI(21．60)。再利用Xhol、胁棚III将人工合成FMDV 基因插入该阳性重组质粒，分别用PCR(以P1和P3为引物)与酶切对重组质粒鉴定，得到阳性重组质粒， VectorNTI 和DNAStar软件分析所插