实验 载体与目的DNA重组分子的转化.pptVIP

;;重组体的检测和转化子的筛选 重组体的检测： 包括重组载体的检测，酶切，PCR检测，杂交，测序等。 转化子的筛选： 抗生素筛选、报告基因、基因生物活性检测等。 ;什么是蓝/白斑筛选？ 　　重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lac Z′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于质粒载体lac Z′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。;β- 半乳糖苷酶 乳糖 → 半乳糖 + 葡萄糖 诱导物： 异乳糖 IPTG（异丙基-β- D – 硫代半乳糖苷） 底物： X – gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷） ; ;（?-半乳糖苷酶）;pUC19;（LacZ基因 N端序列）;?-互补;载体： 多数质粒都含有?半乳糖苷酶的前143个氨基酸的编码序列和调控序列。 编码序列中了包含一个MCS，它不破坏读框，不影响功能 宿主菌： 编码?半乳糖苷酶C端部分序列 分别编码的片段均无活性，但可融为一体，形成具有酶活的蛋白质-- ?-互补 ;Multiple Cloning Sites;来自?-互补的菌在含有X-gal的培养基中形成蓝色菌落 有外源片段插入载体时，导致无?-互补能力的氨基端片段，形成白色菌落 简单的颜色反应给重组子的鉴定带来了极大的方便，从成百上千的转化克隆中可以很容易的挑出携带重组质粒的白色克隆 ;;lacZ;a-互补显色反应（蓝白斑筛选）;实验材料;制备感受态细胞（教师完成） 制备涂菌的琼脂板及鉴定用LB液体培养基。 1. 含Ap的LB固体培养基倒平板(自制), 每组3个(2个加Ap,一个无Ap)，2人一组. (加Ap 15ul/平板) 2. 在其中两个预制的LB（AP＋）平板上，各加40uL 20mg/mL X-gal和40uL 20mg/mL IPTG溶液，并用灭菌涂棒均匀涂布于琼脂凝胶表面。注意：涂棒在酒精灯上烧后需冷却！; 50uL感受态细胞+10uL连接产物， 25uL感受态细胞+2uL无菌水（阴性对照） 混匀，冰上放置30分钟。 42°C水浴，90秒, 冰上放置1-2分钟 每管加900uL LB液体培养基，轻轻混匀，37°C摇床慢摇，温育40分钟 ;连接产物转化管：4000rpm离心5分钟，吸出弃去800uL上清液后，轻轻混匀菌体，将剩余200uL菌液均匀涂布在含x-gal的平板上。 （注意编号!） 阴性对照分别取100uL菌液涂布一个含Ap+平板和一个无Ap平板。 注意：涂棒在酒精灯上烧后需冷却！ 37°C倒置培养过夜。 ;明天观察实验结果， 每人分别挑取阳性克隆于2mLLB（AP+)培养基中，摇床37°C培养12小时后，储存于4 °C冰箱备用，即重组子的鉴定。 每组（2人）挑取3个白色菌落和一个蓝色菌落 ;;2、α-互补;α-互补： 现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主细菌和质粒编码的???段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。 Lac Z′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。 ;4、β-半乳糖苷酶显色反应法