遗传性疾病与分子生物学诊断.ppt

;遗传性疾病 ;一、概述;基因变异致病可分为两种主要类型： 内源基因的变异 外源基因的入侵 ;内源基因的变异：由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，而导致疾病。;表达异常：有些内源基因（如原癌基因）的表达异常则可能导致细胞增生失控而发生肿瘤或其他类型紊乱。;由多基因以及环境因子的相互作用引起的疾病 兔唇（唇裂）、腭裂、脊柱裂等，其子女不患病的概率很高。; 蛋白质变异（分子病） 病症 血红蛋白 镰状红细胞病 珠蛋白 珠蛋白生成障碍性贫血酶变异 先天性代谢缺陷　 已糖激酶 已糠激酶缺乏型溶血性贫血 半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶 半乳糖血症 酪氨酸酶 白化病 磷酸化酶激酶 糖原贮积症 β-葡萄苷酸酶 β-葡糖苷酸酶缺乏症 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮尿症 黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤尿症（或痛风）;二、基因诊断的概念和特点;三、基因诊断的常用技术方法;建立在核酸分子杂交技术基础上的常用基因诊断方法有： （1）限制性内切酶酶谱分析法： 利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。 当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多少)在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。;镰状细胞贫血是β珠蛋白基因第六个密码子发生单个碱基突变(A—T)，谷氨酸被缬氨酸取代所致。由于这一突变而使该基因内部一个MstⅡ限制酶位点丢失。因此，将正常人和带有突变基因个体的基因组DNA用MstⅡ消化后，与β珠蛋白基因探针杂交。;（2）DNA限制性片段长度多态性分析（RFLP）： DNA多态性：在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异(称为中性突变)，中性突变导致个体间核苷酸序列的差异。 限制性片段长度多态性：不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片段。 RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。;（3）等位基因特异寡核苷酸探针杂交法(ASO);若受检者DNA能与M杂交，而不能与N杂交，说明受检者是这种突变的纯合子； 若受检者 DNA既能与M结合，又能与N结合，说明受检者是这种突变基因的杂合子； 若受检者 DNA不能与M结合，但能与N结合，表明受检者不存在这种突变基因； 患者DNA和M、N均不结合，提示其缺陷基因可能是一种新的突变类型。;（二）聚合酶链反应（PCR）; 利用DNA缺失突变区域两侧5“和3‘端引物进行PCR扩增，再通过凝胶电泳观察扩增DNA片段的大小，可诊断中等程度的DNA片段(0．5～1．5 kb)的突变； 用多对PCR引物同时进行PCR的多重PCR技术，可同时对某一特定基因的不同 DNA区域进行缺失诊断。 DNA指纹技术：检测的是基因组DNA中存在的一类特殊的数目可变串联重复多态性（VNTR）。; PCR／单链构象多态性分析(SSCP)： PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，可分析确定致病基因的存在。 相同长度的单链DNA因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在电泳时泳动速率不同。 ;Leber遗传性神经病患者是由于线粒体DNA第11778位碱基(G→A)突变所致。用PCR扩增线粒体DNA相应片段，再作SSCP分析。; PCR／ASO法、PCR／SSCP法、PCR/RFLP法、PCR／限制酶谱法的联合应用